Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngajantenkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Véktor gén pikeun pengobatan fibrosis kistik pulmonal kedah disasarkeun kana saluran konduktif, sabab transduksi paru periferal teu gaduh pangaruh terapi.Efisiensi transduksi virus langsung aya hubunganana sareng waktos tempatna pamawa.Tapi, cairan pangiriman sapertos pembawa gen sacara alami kasebar kana alveoli nalika inhalasi, sareng partikel terapi naon waé bentukna gancang dipiceun ku transportasi mukosiliar.Ngalegaan waktu tinggal operator gen dina saluran pernapasan penting tapi hésé pikeun ngahontal.Partikel magnét pembawa-conjugated anu tiasa diarahkeun ka permukaan saluran pernapasan tiasa ningkatkeun targeting régional.Kusabab masalah sareng pencitraan in vivo, paripolah partikel magnét leutik sapertos dina permukaan saluran napas ku ayana médan magnét anu diterapkeun kirang kahartos.Tujuan tina ulikan ieu nya éta ngagunakeun pencitraan synchrotron pikeun visualize in vivo gerakan runtuyan partikel magnét dina trakea beurit bius dina raraga nalungtik dinamika jeung pola paripolah partikel tunggal jeung bulk dina vivo.Urang lajeng ogé ditaksir naha pangiriman partikel magnét lentiviral ku ayana médan magnét bakal ngaronjatkeun efisiensi transduksi dina trachea beurit.Pencitraan sinar-X Synchrotron nunjukkeun paripolah partikel magnét dina médan magnét stasioner sareng gerak dina vitro sareng in vivo.Partikel teu bisa gampang nyeret sakuliah beungeut airways hirup maké magnét, tapi salila angkutan, deposit ngumpul dina widang view, dimana médan magnét neneng.Efisiensi transduksi ogé ngaronjat genep kali lipet nalika partikel magnét lentiviral dikirimkeun ku ayana médan magnét.Dihijikeun, hasil ieu nunjukkeun yén partikel magnét lentiviral sareng médan magnét tiasa janten pendekatan anu berharga pikeun ningkatkeun targeting vektor gén sareng tingkat transduksi dina saluran konduktif dina vivo.
Cystic fibrosis (CF) disababkeun ku variasi dina gén tunggal disebut CF transmembrane conductance regulator (CFTR).Protéin CFTR mangrupa saluran ion nu aya dina loba sél épitél sakuliah awak, kaasup rél, situs utama dina pathogenesis fibrosis kista.Cacat dina CFTR ngakibatkeun transportasi cai abnormal, dehidrasi tina beungeut airway, sarta turunna airway surface fluid layer (ASL) jerona.Éta ogé ngarusak kamampuan sistem transportasi mukosiliar (MCT) pikeun ngabersihan saluran udara tina partikel sareng patogén anu kaseuseup.Tujuan kami nyaéta pikeun ngembangkeun terapi gén lentiviral (LV) pikeun nganteurkeun salinan gén CFTR anu leres sareng ningkatkeun kaséhatan ASL, MCT, sareng paru-paru, sareng teras ngembangkeun téknologi anyar anu tiasa ngukur parameter ieu dina vivo1.
Vektor LV mangrupakeun salah sahiji calon ngarah pikeun terapi gén cystic fibrosis, utamana sabab bisa ngahijikeun permanén gén terapi kana sél basal airway (sél stem airway).Hal ieu penting sabab bisa mulangkeun hidrasi normal jeung bersihan mukus ku cara ngabedakeun kana sél permukaan jalan napas anu dikoreksi gen fungsional anu aya hubunganana sareng fibrosis kistik, hasilna kauntungan seumur hirup.Véktor LV kudu diarahkeun kana saluran rél konduktif, sabab ieu téh tempat involvement paru dina CF dimimitian.Pangiriman véktor anu langkung jero kana bayah tiasa nyababkeun transduksi alveolar, tapi ieu henteu gaduh pangaruh terapi dina fibrosis kista.Tapi, cairan sapertos pembawa gen sacara alami migrasi kana alveoli nalika kaseuseup saatos ngalahirkeun3,4 sareng partikel terapi gancang diusir kana rohangan lisan ku MCTs.Efisiensi transduksi LV langsung patali jeung lilana waktu vektor tetep deukeut ka sél sasaran pikeun ngidinan uptake sélular - "waktu tinggal" 5 nu gampang disingget ku aliran hawa régional has ogé uptake koordinasi mukus jeung partikel MCT.Pikeun fibrosis kistik, kamampuhan pikeun manjangkeun waktu tinggal LV dina saluran rél penting pikeun ngahontal tingkat luhur transduksi di wewengkon ieu, tapi geus jadi nangtang.
Pikeun ngatasi halangan ieu, kami ngajukeun yén partikel magnét LV (MP) tiasa ngabantosan dina dua cara pelengkap.Kahiji, aranjeunna bisa dipandu ku magnet ka beungeut airway pikeun ngaronjatkeun targeting tur mantuan partikel pamawa gén aya di wewengkon katuhu tina airway;jeung ASL) pindah kana lapisan sél 6. MPs loba dipaké salaku wahana pangiriman ubar sasaran nalika aranjeunna ngabeungkeut antibodi, ubar kémoterapi, atawa molekul leutik lianna nu ngagantelkeun kana mémbran sél atawa ngabeungkeut reséptor permukaan sél masing-masing sarta ngumpulkeun dina situs tumor dina. ayana listrik statik.Médan magnét pikeun terapi kanker 7. Métode "hyperthermic" séjén anu aimed di killing sél tumor ku MPs pemanasan nalika kakeunaan médan magnét osilasi.Prinsip transfeksi magnét, dimana médan magnét dianggo salaku agén transfeksi pikeun ningkatkeun transfer DNA kana sél, biasana dianggo sacara in vitro nganggo sajumlah vektor gén non-viral sareng virus pikeun garis sél anu hese-transduksi. ..Efisiensi LV magnetotransfection kalayan pangiriman LV MP in vitro kana garis sél épitél bronkial manusa ku ayana médan magnét statik didirikan, ngaronjatkeun efisiensi transduksi ku 186 kali dibandingkeun jeung véktor LV nyalira.LV MT ogé geus dilarapkeun ka modél in vitro of cystic fibrosis, dimana transfection magnét ngaronjat transduksi LV dina hawa-cairan panganteur budaya ku faktor 20 ku ayana cystic fibrosis sputum10.Sanajan kitu, dina vivo organ magnetotransfection geus narima rélatif saeutik perhatian sarta geus ngan geus dievaluasi dina sababaraha studi sato11,12,13,14,15, utamana dina lungs16,17.Nanging, kamungkinan transfeksi magnét dina terapi paru-paru dina fibrosis kista jelas.Tan jeung al.(2020) nyatakeun yén "studi validasi ngeunaan pangiriman pulmonal anu épéktip tina nanopartikel magnét bakal muka jalan pikeun strategi inhalasi CFTR ka hareup pikeun ningkatkeun hasil klinis dina penderita fibrosis kista"6.
Paripolah partikel magnét leutik dina beungeut saluran pernapasan ku ayana médan magnét anu diterapkeun hese ditingali sareng diajar, ku kituna aranjeunna kirang kahartos.Dina studi anu sanés, kami parantos ngembangkeun metodeu Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) pikeun pencitraan non-invasif sareng kuantifikasi menit dina parobahan vivo dina jero ASL18 sareng paripolah MCT19,20 pikeun ngukur langsung hidrasi permukaan saluran gas. sarta dipaké salaku hiji éféktivitas perlakuan indikator mimiti.Sajaba ti éta, métode nyetak MCT kami ngagunakeun partikel diaméterna 10-35 µm diwangun ku alumina atawa kaca indéks réfraktif tinggi salaku spidol MCT katempo ku PB-PCXI21.Duanana métode cocog pikeun Imaging sauntuyan tipe partikel, kaasup MPs.
Kusabab resolusi spasial sareng temporal anu luhur, uji ASL sareng MCT basis PB-PCXI kami cocog pikeun diajar dinamika sareng pola paripolah partikel tunggal sareng bulk dina vivo pikeun ngabantosan urang ngartos sareng ngaoptimalkeun metode pangiriman gén MP.Pendekatan anu kami anggo di dieu dumasar kana panilitian kami nganggo beamline SPring-8 BL20B2, dimana urang ngabayangkeun gerakan cairan saatos pangiriman dosis véktor dummy kana saluran irung sareng paru-paru mencit pikeun ngabantosan ngajelaskeun pola ekspresi gen hétérogén kami anu dititénan. dina gén urang.studi sato kalayan dosis carrier 3,4.
Tujuan tina ulikan ieu nyaéta ngagunakeun synchrotron PB-PCXI pikeun ngabayangkeun gerakan in vivo tina séri anggota parlemén dina trakea beurit hirup.Studi pencitraan PB-PCXI ieu dirancang pikeun nguji séri MP, kakuatan médan magnét, sareng lokasi pikeun nangtukeun pangaruhna kana gerakan MP.Kami nganggap yén médan magnét éksternal bakal ngabantosan MF anu dikirimkeun tetep atanapi ngalih ka daérah target.Panaliti ieu ogé ngamungkinkeun urang pikeun nangtukeun konfigurasi magnet anu maksimalkeun jumlah partikel anu tinggaleun dina trakea saatos déposisi.Dina séri kadua studi, kami aimed ngagunakeun konfigurasi optimal ieu pikeun demonstrate pola transduksi hasilna tina pangiriman in vivo of LV-MPs ka rél beurit, dina asumsi yén pangiriman LV-MPs dina konteks targeting airway bakal hasil. dina ngaronjat efisiensi transduksi LV..
Sadaya panilitian sato dilaksanakeun saluyu sareng protokol anu disatujuan ku Universitas Adelaide (M-2019-060 sareng M-2020-022) sareng Panitia Etika Sato Synchrotron SPring-8.Percobaan dilaksanakeun saluyu sareng saran ti ARRIVE.
Sadaya gambar x-ray dicandak dina beamline BL20XU di synchrotron SPring-8 di Jepang nganggo setelan anu sami sareng anu dijelaskeun sateuacana21,22.Sakeudeung, kotak eksperimen ieu lokasina 245 m ti cingcin gudang synchrotron.Jarak sampel-ka-detéktor 0,6 m dipaké pikeun studi pencitraan partikel jeung 0,3 m pikeun studi pencitraan in vivo pikeun nyieun épék kontras fase.Balok monokromatik kalayan énergi 25 keV dipaké.Gambar dicandak nganggo transduser sinar-X resolusi luhur (SPring-8 BM3) gandeng sareng detektor sCMOS.Transduser ngarobah sinar-X jadi cahaya katempo maké scintillator kandel 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), nu tuluy diarahkeun ka sénsor sCMOS maké obyektif mikroskop ×10 (NA 0.3).Detektor sCMOS nyaéta Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepang) kalayan ukuran array 2048 × 2048 piksel sareng ukuran piksel atah 6,5 × 6,5 µm.Setélan ieu méré ukuran piksel isotropik éféktif 0,51 µm jeung widang tempoan kira-kira 1,1 mm × 1,1 mm.Durasi paparan 100 ms dipilih pikeun maksimalkeun rasio sinyal-ka-noise partikel magnét di jero sareng di luar saluran bari ngaminimalkeun artefak gerak anu disababkeun ku engapan.Pikeun studi in vivo, jepret sinar-X gancang disimpen dina jalur sinar-X pikeun ngawates dosis radiasi ku cara ngahalangan sinar-X antara paparan.
Média LV teu dipaké dina sagala studi imaging SPring-8 PB-PCXI sabab chamber BL20XU Imaging teu Biosafety Level 2 Certified.Gantina, urang milih sauntuyan MPs well-dicirikeun ti dua ngical paralatan komérsial ngawengku sauntuyan ukuran, bahan, konsentrasi beusi, sarta aplikasi , - mimitina dina urutan ngartos kumaha médan magnét mangaruhan gerakan MPs dina kapilér kaca, lajeng dina saluran hirup.beungeut.Ukuran MP beda-beda ti 0,25 dugi ka 18 µm sareng didamel tina sababaraha bahan (tingali Tabél 1), tapi komposisi unggal sampel, kalebet ukuran partikel magnét dina MP, teu dipikanyaho.Dumasar kana studi MCT éksténsif kami 19, 20, 21, 23, 24, kami ngaharepkeun yén MPs turun ka 5 µm bisa ditempo dina beungeut airway tracheal, contona, ku subtracting pigura padeukeut pikeun nempo ningkat pisibilitas gerakan MP.MP tunggal 0,25 µm langkung alit tibatan résolusi alat pencitraan, tapi PB-PCXI diperkirakeun ngadeteksi kontras volumetrik sareng gerakan cairan permukaan dimana aranjeunna disimpen saatos disimpen.
Sampel pikeun tiap MP dina tabél.1 disiapkeun dina kapilér kaca 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) kalayan diaméter internal 0,63 mm.Partikel korpuskular sayogi dina cai, sedengkeun partikel CombiMag sayogi dina cairan proprietary produsén.Unggal tabung dieusi satengah cairan (kira-kira 11 µl) sareng disimpen dina wadah sampel (tingali Gambar 1).Kapilér kaca ditempatkeun sacara horisontal dina panggung dina kamar pencitraan, masing-masing, sareng diposisikan dina ujung cair.A 19 mm diaméterna (28 mm panjang) nikel-cangkang magnét dijieunna tina tanah jarang, neodymium, beusi jeung boron (NdFeB) (N35, ucing. No. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) kalawan rémanénsi 1,17 T ieu napel a méja mindahkeun misah pikeun ngahontal Jauh robah posisi anjeun salila Rendering.Pencitraan sinar-X dimimitian nalika magnet diposisikan sakitar 30 mm di luhur sampel sareng gambar dicandak dina 4 pigura per detik.Salila pencitraan, magnét dibawa deukeut ka tube capillary kaca (dina jarak kira-kira 1 mm) lajeng dipindahkeun sapanjang tube ka assess pangaruh kakuatan widang jeung posisi.
Setélan pencitraan in vitro ngandung sampel MP dina kapilér kaca dina tahap tarjamahan sampel xy.Jalur sinar-X ditandaan ku garis dotted beureum.
Sakali visibilitas in vitro MPs diadegkeun, sawaréh di antarana diuji in vivo dina beurit Wistar albino bikang liar (~ 12 minggu heubeul, ~ 200 g).Medetomidine 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Jepang), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Jepang) jeung butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Beurit dibius sareng campuran Pharma (Jepang) ku suntikan intraperitoneal.Saatos anesthesia, maranéhanana disiapkeun pikeun Imaging ku nyoplokkeun bulu sabudeureun trachea, inserting tube endotracheal (ET; 16 Ga intravena cannula, Terumo BCT), sarta immobilizing aranjeunna dina posisi supine dina piring Imaging custom-dijieun ngandung kantong termal. pikeun ngajaga suhu awak.22. piring Imaging ieu lajeng napel tahap sampel dina kotak Imaging dina sudut slight mun align trachea horisontal dina gambar x-ray ditémbongkeun saperti dina Gambar 2a.
(a) Setélan pencitraan in vivo dina unit pencitraan SPring-8, jalur sinar X-ray ditandaan ku garis dotted beureum.(b, c) Lokalisasi magnet tracheal dilaksanakeun jarak jauh nganggo dua kaméra IP anu dipasang sacara ortogonal.Di sisi kénca gambar dina layar, anjeun tiasa ningali loop kawat nyekel sirah na cannula pangiriman dipasang di jero tube ET.
Sistem pompa jarum suntik anu dikontrol jarak jauh (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) nganggo jarum suntik kaca 100 µl dihubungkeun sareng pipa PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) nganggo jarum 30 Ga.Cirian tabung pikeun mastikeun yén tip aya dina posisi anu leres dina trakea nalika ngalebetkeun pipah endotracheal.Ngagunakeun micropump a, plunger jarum suntik ieu dihapus sarta ujung tube ieu immersed dina sampel MP pikeun dikirimkeun.Pipa pangiriman anu dimuat teras diselapkeun kana tabung endotrakeal, nempatkeun ujungna dina bagian anu paling kuat tina médan magnét anu diarepkeun.Akuisisi gambar dikontrol nganggo detektor napas anu nyambung ka kotak timing basis Arduino kami, sareng sadaya sinyal (contona, suhu, réspirasi, jepret kabuka / tutup, sareng akuisisi gambar) dirékam nganggo Powerlab sareng LabChart (Instrumén AD, Sydney, Australia) 22 Nalika Imaging Nalika perumahan teu sadia, dua kaméra IP (Panasonic BB-SC382) anu diposisikan dina kira 90 ° ka silih tur dipaké pikeun ngadalikeun posisi magnet relatif ka trachea salila Imaging (Gambar 2b, c).Pikeun ngaleutikan artefak gerak, hiji gambar per napas dicandak salila dataran aliran pernapasan terminal.
Magnét digantelkeun kana tahap kadua, anu tiasa aya jarak jauh di luar awak pencitraan.Rupa-rupa posisi sareng konfigurasi magnet diuji, kalebet: disimpen dina sudut 30 ° di luhur trachea (konfigurasi dipidangkeun dina Gambar 2a sareng 3a);hiji magnet luhureun sato jeung lianna di handap, jeung kutub diatur pikeun atraksi (Gambar 3b)., hiji magnet luhureun sato jeung hiji handap, jeung kutub diatur pikeun repulsion (Gambar 3c), sarta hiji magnet luhur sarta jejeg trachea nu (Gambar 3d).Saatos nyetél sato sareng magnet sareng ngamuat MP anu diuji kana pompa jarum suntik, kirimkeun dosis 50 µl dina laju 4 µl / detik saatos nyandak gambar.Magnét ieu lajeng dipindahkeun deui mudik sapanjang atawa sakuliah trachea bari terus acquire gambar.
Konfigurasi magnét pikeun pencitraan in vivo (a) hiji magnet di luhur trakea dina sudut kira-kira 30°, (b) dua magnet dikonpigurasi pikeun daya tarik, (c) dua magnet dikonpigurasi pikeun repulsion, (d) hiji magnet di luhur sarta jejeg trakéa.Pengamat ningali ka handap tina sungut ka bayah ngaliwatan trakea jeung sinar X-ray nembus sisi kénca beurit jeung exited sisi katuhu.Magnétna digerakkeun sapanjang panjang jalan napas atanapi kénca-katuhu luhureun trakea dina arah sinar-X.
Kami ogé narékahan pikeun nangtukeun pisibilitas sareng paripolah partikel dina saluran rél henteuna pergaulan réspirasi sareng denyut jantung.Ku alatan éta, dina ahir periode Imaging, sato anu humanely euthanized alatan overdose pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Pameuntasan, AS; ~ 65 mg / kg ip).Sababaraha sato ditinggalkeun dina platform pencitraan, sarta sanggeus eureun engapan sarta keteg jajantung, prosés pencitraan diulang, nambahan hiji dosis tambahan MP lamun euweuh MP katempo dina beungeut airway.
Gambar anu dihasilkeun dilereskeun pikeun médan anu datar sareng poék teras dirakit kana pilem (20 pigura per detik; 15-25 × laju normal gumantung kana laju réspirasi) nganggo skrip khusus anu ditulis dina MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Sadaya panilitian ngeunaan pangiriman vektor gén LV dilaksanakeun di Pusat Panaliti Sato Laboratorium Universitas Adelaide sareng tujuanana ngagunakeun hasil percobaan SPring-8 pikeun meunteun naha pangiriman LV-MP dina ayana médan magnét tiasa ningkatkeun transfer gén dina vivo. .Pikeun meunteun épék MF sareng médan magnét, dua kelompok sato dirawat: hiji kelompok disuntik ku LV MF kalayan panempatan magnet, sareng kelompok anu sanés disuntik sareng kelompok kontrol kalayan LV MF tanpa magnet.
Véktor gén LV geus dihasilkeun ngagunakeun métode ditétélakeun saméméhna 25, 26.Véktor LacZ nganyatakeun gén béta-galactosidase lokal lokal anu didorong ku promotor konstitutif MPSV (LV-LacZ), anu ngahasilkeun produk réaksi biru dina sél anu ditransduksi, katingali dina payun sareng bagian jaringan paru-paru.Titrasi dilakukeun dina kultur sél ku cara ngitung sacara manual jumlah sél positif LacZ nganggo hémositometer pikeun ngitung titer dina TU / ml.Carriers anu cryopreserved dina -80 ° C, thawed saméméh pamakéan, sarta kabeungkeut CombiMag ku Pergaulan 1: 1 jeung incubating dina és salila sahenteuna 30 menit saméméh pangiriman.
Beurit Sprague Dawley normal (n = 3 / grup, ~ 2-3 ip dibius kalayan campuran 0.4mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) sareng 60mg / kg ketamine (Ilium, Australia) dina umur 1 bulan) ip ) suntik sareng kanulasi lisan non-bedah sareng kanula intravena 16 Ga.Pikeun mastikeun yén jaringan saluran pernapasan tracheal nampi transduksi LV, éta dikondisikeun nganggo protokol perturbasi mékanis anu dijelaskeun sateuacana dimana permukaan jalan napas trakea digosok sacara aksial nganggo karanjang kawat (N-Circle, ekstrak batu nitinol tanpa tip NTSE-022115) -UDH, Cook Médis, AS) 30 p28.Teras, sakitar 10 menit saatos gangguan dina kabinet biosafety, administrasi tracheal LV-MP dilaksanakeun.
Médan magnét anu digunakeun dina percobaan ieu dikonpigurasikeun sami sareng ulikan sinar-x in vivo, kalayan magnet anu sami dicekel dina trakea sareng clamps stent distilasi (Gambar 4).Volume 50 µl (2 x 25 µl aliquots) LV-MP dikirimkeun ka trakea (n = 3 sato) ngagunakeun pipette gél-tipped sakumaha ditétélakeun saméméhna.Grup kontrol (n = 3 sasatoan) narima sarua LV-MP tanpa pamakéan magnet a.Saatos infusion parantos réngsé, kanula dipiceun tina tabung endotracheal sareng sato diekstubasi.Magnét tetep dina tempatna salami 10 menit sateuacan dipiceun.Beurit anu dosed subcutaneously kalawan meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Australia) dituturkeun ku ditarikna anesthesia ku suntikan intraperitoneal 1 mg / kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia).Beurit dijaga haneut sareng dititénan dugi ka pulih lengkep tina anesthesia.
Alat pangiriman LV-MP dina kabinét kaamanan biologis.Anjeun tiasa ningali yén leungeun baju Luer-konci abu lampu tina tabung ET protrudes tina sungut, sarta ujung pipette gél ditémbongkeun dina gambar diselapkeun ngaliwatan tube ET ka jero nu dipikahoyong kana trachea nu.
Hiji minggu sanggeus prosedur administrasi LV-MP, sato anu humanely kurban ku inhalation of 100% CO2 sarta éksprési LacZ ieu ditaksir ngagunakeun perlakuan X-gal baku urang.Tilu cingcin kartilage paling caudal dihapus pikeun mastikeun yén sagala karuksakan mékanis atawa ingetan cairan alatan panempatan tube endotracheal moal kaasup kana analisis.Unggal trakea dipotong lengthwise pikeun ménta dua halves pikeun analisis jeung disimpen dina cangkir ngandung karét silicone (Sylgard, Dow Inc) ngagunakeun jarum Minutien (Fine Élmu Pakakas) pikeun visualize beungeut luminal.Distribusi sareng karakter sél anu ditransduksi dikonfirmasi ku fotografi frontal nganggo mikroskop Nikon (SMZ1500) kalayan kaméra DigiLite sareng parangkat lunak TCapture (Tucsen Photonics, China).Gambar anu kaala dina 20x magnification (kaasup setelan maksimum pikeun rubak pinuh trachea nu), kalawan sakabéh panjang trachea ditampilkeun step by step, nyadiakeun cukup tumpang tindihna antara unggal gambar pikeun ngidinan gambar "dijahit".Gambar tina unggal trakea lajeng digabungkeun jadi hiji gambar komposit ngagunakeun Composite Image Editor versi 2.0.3 (Microsoft Research) ngagunakeun algoritma gerak planar. Wewengkon éksprési LacZ dina gambar komposit tracheal tina unggal sato diukur nganggo skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) sakumaha anu dijelaskeun sateuacana28, nganggo setélan 0.35 <Hue <0.58, Saturasi> 0.15, sareng Nilai <0.7. Wewengkon éksprési LacZ dina gambar komposit tracheal tina unggal sato diukur nganggo skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) sakumaha anu dijelaskeun sateuacana28, nganggo setélan 0.35 <Hue <0.58, Saturasi> 0.15, sareng Nilai <0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно оторедозлелелмипона с о сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранеее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщензносить иеч > 0 ,7. Wewengkon éksprési LacZ dina gambar tracheal komposit tina unggal sato diukur nganggo skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) sakumaha anu dijelaskeun sateuacana28 nganggo setélan 0.35.0,15 jeung nilai <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中後茶图像中茶行，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图的訏 图使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。 ....................................... HIP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использинароця MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и зна 7,чение . Wewengkon éksprési LacZ dina gambar komposit tina trakea unggal sato diukur nganggo skrip MATLAB otomatis (R2020a, MathWorks) sakumaha anu dijelaskeun sateuacana nganggo setélan 0.35 <hue <0.58, jenuh> 0.15 sareng nilai <0.7.Ku nyukcruk kontur jaringan dina GIMP v2.10.24, masker dijieun sacara manual pikeun tiap gambar komposit pikeun ngaidentipikasi wewengkon jaringan jeung nyegah sagala deteksi palsu di luar jaringan tracheal.Wewengkon patri tina sakabéh gambar komposit ti unggal sato dijumlahkeun pikeun masihan total aréa patri pikeun sato éta.Wewengkon anu dicét teras dibagi ku total daérah topéng pikeun kéngingkeun daérah anu dinormalisasi.
Masing-masing trakea diasupkeun kana parafin sareng dibagi kana ketebalan 5 µm.Bagian anu counterstained kalawan beureum gancang nétral pikeun 5 menit jeung gambar anu kaala maké mikroskop Nikon Eclipse E400, kaméra DS-Fi3 sarta software newak unsur NIS (versi 5.20.00).
Sadaya analisa statistik dilakukeun dina GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Signifikansi statistik disetel dina p ≤ 0,05.Normalitas diuji ngagunakeun tés Shapiro-Wilk sarta béda dina ngawarnaan LacZ ditaksir ngagunakeun t-test unpaired.
Genep MPs dijelaskeun dina Table 1 ieu nalungtik ku PCXI, sarta pisibilitas digambarkeun dina Table 2. Dua polystyrene MPs (MP1 jeung MP2; 18 µm jeung 0.25 µm, masing-masing) teu katempo ku PCXI, tapi sampel sésana bisa dicirikeun. (conto ditémbongkeun dina Gambar 5).MP3 sareng MP4 katingalina lemah (10-15% Fe3O4; 0.25 µm sareng 0.9 µm, masing-masing).Sanajan MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) ngandung sababaraha partikel pangleutikna diuji, éta nu paling diucapkan.Produk CombiMag MP6 hese ngabedakeun.Dina sagala hal, pangabisa urang pikeun ngadeteksi MFs ieu greatly ningkat ku cara ngagerakkeun magnet deui mudik sajajar jeung kapiler.Nalika magnét ngajauhan kapilér, partikel ditarik kaluar dina ranté panjang, tapi nalika magnet ngadeukeutan sareng kakuatan médan magnét ningkat, ranté partikel disingget nalika partikel migrasi ka arah permukaan luhur kapilér (tingali Video Suplemén S1). : MP4), ngaronjatkeun dénsitas partikel dina beungeut cai.Sabalikna, nalika magnét dicabut tina kapilér, kakuatan médan turun sareng anggota parlemén nyusun ulang kana ranté panjang anu ngalegaan ti permukaan luhur kapilér (tingali Pidéo Tambahan S2: MP4).Saatos magnét lirén obah, partikel-partikel terus gerak pikeun sawatara waktu sanggeus ngahontal posisi kasatimbangan.Nalika MP ngalir ka arah sareng ngajauhan permukaan luhur kapilér, partikel magnét condong ngagambar lebu ngalangkungan cairan.
Visibilitas MP dina PCXI béda-béda pisan antara sampel.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 jeung (d) MP6.Sadaya gambar anu dipidangkeun di dieu dicandak nganggo magnet anu diposisikan sakitar 10 mm langsung di luhur kapilér.Bunderan ageung anu katingali nyaéta gelembung hawa anu kajebak dina kapilér, jelas nunjukkeun ciri ujung hideung sareng bodas tina gambar kontras fase.Kotak beureum nunjukkeun pembesaran anu ningkatkeun kontrasna.Catet yén diaméter sirkuit magnét dina sakabéh inohong teu skala na kira 100 kali leuwih badag batan ditémbongkeun.
Nalika magnét pindah ka kénca sareng ka katuhu sapanjang luhureun kapilér, sudut senar MP robih pikeun align sareng magnet (tingali Gambar 6), ku kituna ngagambarkeun garis médan magnét.Pikeun MP3-5, sanggeus chord ngahontal sudut bangbarung, partikel nyered sapanjang beungeut luhur kapilér.Ieu sering nyababkeun anggota parlemén ngagabung kana grup anu langkung ageung caket tempat médan magnét anu paling kuat (tingali Pidéo Tambahan S3: MP5).Ieu ogé utamana dibuktikeun nalika pencitraan deukeut tungtung kapilér, nu ngabalukarkeun MP pikeun agrégat sarta konsentrasi dina panganteur cair-hawa.Partikel dina MP6, nu éta harder ngabedakeun ti nu di MP3-5, teu nyered nalika magnét dipindahkeun sapanjang kapilér, tapi MP string dissociated, ninggalkeun partikel dina pintonan (tingali Suplemén Video S4: MP6).Dina sababaraha kasus, nalika médan magnét anu diterapkeun diréduksi ku cara ngagerakkeun magnét dina jarak anu jauh ti situs pencitraan, sésa-sésa MPs lalaunan turun ka permukaan handap tabung ku gravitasi, tetep aya dina senar (tingali Pidéo Tambahan S5: MP3). .
Sudut senar MP robah nalika magnét pindah ka katuhu luhureun kapilér.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 jeung (d) MP6.Kotak beureum nunjukkeun pembesaran anu ningkatkeun kontrasna.Punten dicatet yén video tambahan kanggo tujuan inpormasi sabab nembongkeun struktur partikel penting sareng inpormasi dinamis anu teu tiasa ditingali dina gambar statik ieu.
Tés kami parantos nunjukkeun yén ngagerakkeun magnet deui-mudik lalaunan sapanjang trakea ngagampangkeun visualisasi MF dina kontéks gerakan kompleks dina vivo.Teu aya tés in vivo anu dilakukeun sabab manik polystyrene (MP1 sareng MP2) henteu katingali dina kapilér.Masing-masing tina opat MF sésana diuji sacara in vivo kalayan sumbu panjang magnet diposisikan dina trakea dina sudut kira-kira 30 ° ka vertikal (tingali Gambar 2b sareng 3a), sabab ieu nyababkeun ranté MF langkung panjang sareng langkung efektif. ti magnét..konfigurasi terminated.MP3, MP4 sareng MP6 teu acan kapendak dina trakea sato hirup.Nalika ngabayangkeun saluran pernapasan beurit saatos maéhan sato sacara manusiawi, partikel-partikel tetep teu katingali sanajan volume tambahan ditambah nganggo pompa jarum suntik.MP5 ngagaduhan eusi oksida beusi anu paling luhur sareng mangrupikeun hiji-hijina partikel anu katingali, ku kituna dianggo pikeun ngaevaluasi sareng ngacirian paripolah MP dina vivo.
Penempatan magnet dina trakea nalika nyelapkeun MF nyababkeun seueur, tapi henteu sadayana, MF konsentrasi dina bidang pandang.Asupna tracheal partikel pangalusna dititénan dina sato humanely euthanized.Gambar 7 sareng Video Suplemén S6: MP5 nunjukkeun newak magnét gancang sareng alignment partikel dina permukaan trakea véntral, nunjukkeun yén MP tiasa nargétkeun ka daérah trakea anu dipikahoyong.Nalika milarian langkung jauh sapanjang trakea saatos pangiriman MF, sababaraha MF kapanggih langkung caket kana carina, anu nunjukkeun kakuatan médan magnét anu teu cekap pikeun ngumpulkeun sareng nahan sadaya MF, sabab dikirimkeun ngaliwatan daérah kakuatan médan magnét maksimal salami administrasi cairan.prosés.Sanajan kitu, konséntrasi MP postnatal leuwih luhur di sabudeureun wewengkon gambar, suggesting yén loba MPs tetep di wewengkon airway dimana kakuatan médan magnét dilarapkeun éta pangluhurna.
Gambar (a) sateuacan sareng (b) saatos pangiriman MP5 kana trakea beurit anu nembé di-euthanized kalayan magnet disimpen di luhur daérah pencitraan.Wewengkon anu digambarkeun ayana di antara dua cingcin cartilaginous.Aya sababaraha cairan dina saluran pernapasan sateuacan MP dikirimkeun.Kotak beureum nunjukkeun pembesaran anu ningkatkeun kontrasna.Gambar ieu dicandak tina pidéo anu dipidangkeun dina S6: Pidéo Suplemén MP5.
Mindahkeun magnet sapanjang trachea in vivo nyababkeun parobahan dina sudut ranté MP dina beungeut airway, sarupa jeung nu dititénan dina kapilér (tingali Gambar 8 jeung Suplemén Video S7: MP5).Sanajan kitu, dina ulikan urang, MPs teu bisa nyeret sapanjang beungeut tracts engapan hirup, sakumaha kapilér bisa ngalakukeun.Dina sababaraha kasus, ranté MP manjang nalika magnét pindah ka kénca jeung ka katuhu.Narikna, kami ogé mendakan yén ranté partikel ngarobih jero lapisan permukaan cairan nalika magnét digerakkeun sacara longitudinal sapanjang trakea, sareng ngalegaan nalika magnét digerakkeun langsung di luhur sareng ranté partikel diputar ka posisi nangtung (tingali. Pidéo tambahan S7).: MP5 di 0:09, katuhu handap).Pola gerakan karakteristik robah nalika magnét dipindahkeun laterally sakuliah luhureun trachea (ie, ka kénca atawa katuhu sato, tinimbang sapanjang panjang trachea).Partikel-partikel éta masih katingali jelas nalika gerakanna, tapi nalika magnét dicabut tina trakea, ujung-ujung senar partikel katingali (tingali Pidéo Tambahan S8: MP5, mimitian jam 0:08).Ieu satuju jeung paripolah observasi tina médan magnét dina aksi hiji médan magnét dilarapkeun dina kapilér kaca.
Gambar conto anu nunjukkeun MP5 dina trakea beurit anu dibius hirup.(a) Magnét dipaké pikeun meunangkeun gambar di luhur jeung ka kénca trakéa, terus (b) sanggeus mindahkeun magnet ka katuhu.Kotak beureum nunjukkeun pembesaran anu ningkatkeun kontrasna.Gambar ieu tina pidéo anu dipidangkeun dina Pidéo Suplemén S7: MP5.
Nalika dua kutub disetel dina orientasi kalér-kidul luhur jeung handap trakea (ie, attracting; Gbr. 3b), chord MP mucunghul leuwih panjang sarta lokasina dina témbok gurat trakea tinimbang dina beungeut dorsal tina trakea. trakea (tingali Appendix).Video S9:MP5).Tapi, konséntrasi partikel anu luhur dina hiji situs (nyaéta, permukaan dorsal trachea) henteu dideteksi saatos administrasi cairan nganggo alat magnet ganda, anu biasana lumangsung sareng alat magnet tunggal.Lajeng, nalika hiji magnet ieu ngonpigurasi pikeun ngusir kutub sabalikna (Gambar 3c), jumlah partikel ditingali dina widang view teu ngaronjat sanggeus pangiriman.Nyetél dua konfigurasi magnét nyaéta nangtang kusabab kakuatan médan magnét anu luhur anu narik atanapi ngadorong magnet masing-masing.Setelan ieu lajeng dirobah jadi magnet tunggal sajajar jeung rél tapi ngaliwatan saluran rél dina sudut 90 derajat sahingga garis gaya meuntas témbok tracheal ortogonally (Gambar 3d), hiji orientasi dimaksudkeun pikeun nangtukeun kamungkinan aggregation partikel on. dinding lateral.diperhatikeun.Nanging, dina konfigurasi ieu, teu aya gerakan akumulasi MF anu tiasa diidentipikasi atanapi gerakan magnet.Dumasar kana sadaya hasil ieu, konfigurasi sareng magnet tunggal sareng orientasi 30-gelar dipilih pikeun studi in vivo operator gen (Gbr. 3a).
Lamun sato ieu imaged sababaraha kali langsung saatos keur humanely kurban, henteuna interfering gerak jaringan dimaksudkan yén finer, garis partikel pondok bisa discerned dina widang intercartilaginous jelas, 'swaying' luyu jeung gerak translasi magnet.jelas ningali ayana jeung gerak partikel MP6.
Titer LV-LacZ nyaéta 1,8 x 108 IU/mL, sareng saatos nyampur 1: 1 sareng CombiMag MP (MP6), sato disuntik kalayan 50 µl dosis tracheal 9 x 107 IU / ml kendaraan LV (ie 4,5). x 106 TU/beurit).).).Dina studi ieu, tinimbang mindahkeun magnet salila kuli, urang ngalereskeun magnet dina hiji posisi pikeun nangtukeun naha transduksi LV bisa (a) ningkat dibandingkeun pangiriman vektor dina henteuna médan magnét, sarta (b) lamun airway bisa. jadi fokus.Sél anu ditransduksi di daérah target magnét saluran pernapasan luhur.
Ayana magnét sareng panggunaan CombiMag dina kombinasi sareng véktor LV henteu katingalina mangaruhan kaséhatan sato, sapertos protokol pangiriman vektor LV standar urang.Gambar frontal wewengkon tracheal subjected ka perturbation mékanis (Suplemén Gbr. 1) némbongkeun yén grup LV-MP dirawat miboga tingkat nyata luhur transduksi ku ayana magnet a (Gbr. 9a).Ngan sajumlah leutik ngawarnaan LacZ biru anu aya dina kelompok kontrol (Gambar 9b).Quantification of X-Gal-patri wewengkon dinormalisasi némbongkeun yén administrasi LV-MP ku ayana médan magnét nyababkeun paningkatan kira-kira 6-melu (Gbr. 9c).
Conto gambar komposit némbongkeun transduksi tracheal kalawan LV-MP (a) dina ayana médan magnét jeung (b) dina henteuna magnet.(c) Pamutahiran anu signifikan sacara statistik dina daérah normalisasi transduksi LacZ dina trakea kalayan ngagunakeun magnet (*p = 0.029, uji-t, n = 3 per grup, rata-rata ± kasalahan standar rata-rata).
nétral gancang bagian beureum-patri (conto ditémbongkeun dina Suplemén Gbr. 2) nunjukkeun yén sél LacZ-patri éta hadir dina sampel sarua jeung di lokasi anu sarua sakumaha dilaporkeun saméméhna.
Tantangan konci dina terapi gen jalan napas tetep lokalisasi tepat partikel pembawa di daérah anu dipikaresep sareng ngahontal tingkat efisiensi transduksi anu luhur dina paru-paru sélulér ku ayana aliran udara sareng bersihan mukus aktip.Pikeun operator LV dimaksudkeun pikeun pengobatan kasakit engapan dina fibrosis kistik, ngaronjatna waktu tinggal partikel pamawa dina rél konduktif geus hitherto jadi tujuan unattainable.Salaku nunjuk kaluar ku Castellani et al., pamakéan médan magnét pikeun ningkatkeun transduksi boga kaunggulan leuwih métode pangiriman gén lianna kayaning éléktroporasi sabab bisa ngagabungkeun kesederhanaan, ékonomi, pangiriman localized, ngaronjat efisiensi, sarta waktu inkubasi pondok.jeung kamungkinan dosis handap kandaraan10.Tapi, déposisi in vivo sareng paripolah partikel magnét dina saluran rél dina pangaruh gaya magnét luar teu acan kantos dijelaskeun, sareng kanyataanna kamampuan metode ieu pikeun ningkatkeun tingkat éksprési gén dina saluran napas hirup gembleng teu acan ditingalikeun dina vivo.
Percobaan in vitro kami dina PCXI synchrotron nunjukkeun yén sadaya partikel anu kami uji, iwal ti polystyrene MP, katingali dina setélan pencitraan anu kami anggo.Dina ayana médan magnét, médan magnét ngabentuk senar, anu panjangna aya hubunganana sareng jinis partikel sareng kakuatan médan magnét (nyaéta, jarak sareng gerakan magnet).Ditémbongkeun saperti dina Gambar 10, string urang niténan kabentuk salaku unggal partikel individu jadi magnetized sarta induces médan magnét lokal sorangan.Widang anu misah ieu nyababkeun partikel anu sami pikeun ngumpulkeun sareng nyambungkeun gerakan string grup kusabab gaya lokal tina gaya tarik lokal sareng tolak partikel sanés.
Diagram nunjukkeun (a, b) ranté partikel ngabentuk di jero kapiler anu ngeusi cairan sareng (c, d) trakea anu ngeusi hawa.Catet yén kapilér sareng trakea henteu ditarik kana skala.Panel (a) ogé ngandung pedaran ngeunaan MF ngandung partikel Fe3O4 disusun dina ranté.
Nalika magnet dipindahkeun ngaliwatan kapilér nu, sudut string partikel ngahontal bangbarung kritis pikeun MP3-5 ngandung Fe3O4, nu satutasna string partikel euweuh tetep dina posisi aslina, tapi dipindahkeun sapanjang permukaan ka posisi anyar.magnét.Éfék ieu dipikaresep lumangsung alatan beungeut capillary kaca cukup lemes pikeun ngidinan gerakan ieu lumangsung.Narikna, MP6 (CombiMag) henteu kalakuanana sapertos kitu, sigana kusabab partikelna langkung alit, ngagaduhan palapis atanapi permukaan permukaan anu béda, atanapi cairan pembawa proprietary mangaruhan kamampuan gerak.Kontras dina gambar partikel CombiMag ogé leuwih lemah, nunjukkeun yén cair jeung partikel bisa boga dénsitas sarua sahingga teu bisa gampang pindah ka arah silih.Partikel ogé tiasa nyangkut upami magnét gerak gancang teuing, nunjukkeun yén kakuatan médan magnét teu tiasa salawasna ngatasi gesekan antara partikel dina cairan, nunjukkeun yén kakuatan médan magnét sareng jarak antara magnet sareng daérah target henteu kedah janten a reuwas.penting.Hasil ieu ogé nunjukkeun yén sanajan magnét bisa nangkep loba microparticles ngalir ngaliwatan wewengkon target, teu mungkin magnet bisa diandelkeun pikeun mindahkeun partikel CombiMag sapanjang beungeut trachea nu.Ku kituna, urang menyimpulkan yén dina vivo LV MF studi kedah ngagunakeun médan magnét statik pikeun fisik sasaran wewengkon husus tina tangkal airway.
Sakali partikel anu dikirimkeun kana awak, aranjeunna hese pikeun ngaidentipikasi dina konteks jaringan pindah kompléks awak, tapi kamampuhan deteksi maranéhanana geus ningkat ku cara ngagerakkeun magnet horisontal ngaliwatan trachea pikeun "wiggle" senar MP.Nalika pencitraan sacara real-time mungkin, langkung gampang pikeun ngabédakeun gerakan partikel saatos sato dibunuh sacara manusiawi.Konsentrasi MP biasana pangluhurna di lokasi ieu nalika magnét diposisikan dina daérah pencitraan, sanaos sababaraha partikel biasana kapanggih langkung handap trakea.Teu kawas studi in vitro, partikel teu bisa nyeret handap trachea ku gerakan magnet.Temuan ieu konsisten sareng kumaha mukus anu nyertakeun permukaan trakea biasana ngolah partikel anu diseuseup, ngajebak aranjeunna dina mukus teras ngabersihkeunana ngaliwatan mékanisme bersihan muko-ciliary.
Urang hipotésis yén ngagunakeun magnét luhur jeung handap trachea pikeun atraksi (Gbr. 3b) bisa ngahasilkeun médan magnét leuwih seragam, tinimbang médan magnét anu kacida kentel dina hiji titik, berpotensi ngahasilkeun sebaran leuwih seragam partikel..Tapi, ulikan awal urang henteu mendakan bukti anu jelas pikeun ngadukung hipotésis ieu.Nya kitu, netepkeun sapasang magnét pikeun repulse (Gbr. 3c) teu ngakibatkeun leuwih partikel settling di wewengkon gambar.Dua panemuan ieu nunjukkeun yén setelan dual-magnét henteu sacara signifikan ningkatkeun kontrol lokal pikeun nunjuk MP, sareng yén kakuatan magnét anu kuat anu dihasilkeun hese disetel, ngajantenkeun pendekatan ieu kirang praktis.Nya kitu, orienting magnet di luhur sarta sakuliah trachea (Gambar 3d) ogé teu nambahan jumlah partikel sésana di wewengkon imaged.Sababaraha konfigurasi alternatif ieu tiasa henteu suksés sabab nyababkeun panurunan dina kakuatan médan magnét dina zona déposisi.Ku kituna, konfigurasi magnet tunggal dina 30 darajat (Gbr. 3a) dianggap pangbasajanna tur pang éfisiénna dina metoda nguji vivo.
Ulikan LV-MP némbongkeun yén nalika vektor LV digabungkeun jeung CombiMag sarta dikirimkeun sanggeus fisik kaganggu ku ayana médan magnét, tingkat transduksi ngaronjat sacara signifikan dina trachea dibandingkeun kadali.Dumasar kana studi pencitraan synchrotron sareng hasil LacZ, médan magnét katingalina tiasa ngajaga LV dina trakea sareng ngirangan jumlah partikel véktor anu langsung nembus ka jero paru-paru.Perbaikan targeting sapertos tiasa ngakibatkeun efisiensi anu langkung luhur bari ngirangan titer anu dikirimkeun, transduksi non-sasaran, efek samping radang sareng imun, sareng biaya transfer gen.Anu penting, numutkeun produsén, CombiMag tiasa dianggo digabungkeun sareng metode transfer gen anu sanés, kalebet vektor virus sanés (sapertos AAV) sareng asam nukléat.