Giardia duodenum nyaéta organisme parasit anu ngabalukarkeun giardiasis, inféksi peujit utamana umum di barudak ngora kalawan tanda klinis diare.Urang saméméhna geus dilaporkeun yén extracellular G. duodenalis micu aktivasina of intrasélular oligomerization-kawas reséptor 3 (NLRP3) ngariung nukléotida tur ngatur réspon radang host ngaliwatan sékrési extracellular vesicle (EV).Sanajan kitu, pola molekular pasti tina patogén-pakait duodenococcal EV (GEV) aub dina prosés ieu jeung peran NLRP3 inflammasome di giardiasis tetep elucidated.
Plasmid ekspresi eukariot rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 jeung alpha-7.3 giardins dina GEV diwangun, ditransfeksi kana makrofag peritoneal primér beurit, sarta dideteksi ku cara ngukur molekul target peradangan caspase-1.Tingkat ekspresi p20 disaring..G. duodenalis alfa-2 jeung alfa-7.3 giardines asalna diidentipikasi ku ngukur NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 béta [IL-1β], pro-caspase-1 jeung caspase-1 p20), sékrési IL.1β, tingkat oligomerization protéin spotted apoptosis (ASC), sareng lokalisasi immunofluoresensi NLRP3 sareng ASC.Peran tina inflammasome NLRP3 dina pathogenicity of G. duodenalis ieu lajeng ditaksir maké mencit nu aktivasina NLRP3 ieu diblokir (NLRP3 diblokir mencit) jeung parobahan patologis dina beurat awak, beban parasit duodenal, sarta jaringan duodenal anu diawaskeun.Sajaba ti éta, urang nalungtik naha hiardines alfa-2 jeung alfa-7.3 dipicuna sékrési IL-1β di vivo via inflammasome NLRP3 sarta nangtukeun peran molekul ieu dina pathogenicity of G. duodenalis di mencit.
Alfa-2 sareng alfa-7.3 giardines nyababkeun aktivasina tina inflammasome NLRP3 in vitro.Ieu nyababkeun aktivasina p20 caspase-1, paningkatan tingkat ekspresi NLRP3, pro-IL-1β, sareng pro-caspase-1 protéin, paningkatan anu signifikan dina sékrési IL-1β, formasi bintik ASA dina sitoplasma, sareng induksi oligomerisasi ASA.peradangan NLRP3 Penile leungitna exacerbates nu pathogenicity of G. duodenalis di mencit.Beurit anu dirawat ku kista ku gavage ti beurit anu diblokir NLRP3 nunjukkeun paningkatan jumlah trofozoit sareng karusakan parah kana villi duodenal, dicirikeun ku crypts necrotic kalayan shrunken sareng branching.Dina percobaan vivo geus ditémbongkeun yén giardines alfa-2 jeung alfa-7.3 bisa dipicuna sékrési IL-1β via inflammasome NLRP3, sarta imunisasi jeung giardines alfa-2 jeung alfa-7.3 ngurangan pathogenicity of G. duodenalis dina mencit.
Dicokot babarengan, hasil ulikan ieu nunjukkeun yén giardia alfa-2 jeung alfa-7.3 ngabalukarkeun upregulation of peradangan host NLRP3 sarta ngurangan infectivity of G. duodenalis di mencit, nu mangrupakeun target ngajangjikeun pikeun nyegah giardiasis.
Giardia duodenum mangrupikeun parasit protozoa ekstrasélular anu hirup dina peujit leutik sareng nyababkeun 280 juta kasus giardiasis kalayan diare unggal taun, khususna di barudak ngora di nagara berkembang [1].Jalma jadi kainféksi ku cai nginum atawa kadaharan kacemar ku M. duodenum cysts, nu lajeng asup kana burih sarta dikaluarkeun dina juices lambung.Giardia duodenum trophozoites ngagantelkeun kana épitél duodenal, ngabalukarkeun seueul, utah, diare, nyeri beuteung, sarta leungitna beurat.Jalma anu kakurangan tina immunodeficiency sareng fibrosis kistik rentan ka inféksi.Inféksi ogé bisa lumangsung ngaliwatan oral jeung anal sex [2].Ubar sapertos metronidazole, tinidazole, sareng nitazoxanide mangrupikeun pilihan perawatan anu dipikaresep pikeun inféksi duodenal [3].Sanajan kitu, ubar kémoterapi ieu ngabalukarkeun efek samping ngarugikeun kayaning seueul, carcinogenesis, sarta genotoxicity [4].Ku alatan éta, strategi leuwih éféktif perlu dimekarkeun pikeun nyegah inféksi G. duodenalis.
Inflammasomes mangrupikeun kelas kompléx protéin sitosol anu mangrupikeun bagian tina réspon imun bawaan, ngabantosan ngajaga ngalawan invasi patogén sareng nyapih réspon radang [5].Diantara inflammasomes ieu, nucleotide-binding oligomerization (NOD) reséptor 3 (NLRP3) nucleotide-binding oligomerization (NLRP3) nucleotide-binding-like inflammasome geus ditalungtik sacara éksténsif sabab bisa dideteksi ku rupa-rupa patogén/pola molekular nu patali jeung karuksakan (PAMP). DAMP), ngakuan, ngaktifkeun sistem imun bawaan.sarta ngatur homeostasis peujit dina loba kasakit radang [6,7,8].Ieu diwangun ku reséptor pangakuan pola (PRR) NLRP3, hiji adaptor apoptotic spotted protéin (ASC), sarta hiji effector procaspase-1 atawa procaspase-11.The NLRP3 inflammasome tindakan minangka host ngalawan invasi patogén, sakumaha observasi dina Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], sarta studi Leishmania.[11], tapi ogé geus dilaporkeun yén aktivasina tina inflammasome NLRP3 watesan réspon imun pelindung sarta exacerbates progression kasakit, contona, dina cacing [12].Dumasar papanggihan urang saméméhna, urang dilaporkeun yén extracellular G. duodenalis micu aktivasina intrasélular of peradangan NLRP3 na modulates réspon radang host ku secreting vesikel extracellular (EVs) [13].Sanajan kitu, peran tina inflammasome NLRP3 di G. duodenalis inféksi in vivo tetep bisa ditangtukeun.
Giardins asalna digambarkeun salaku komponén struktural G. duodenalis sitoskeleton sarta maénkeun peran penting dina motilitas trophozoite jeung kantétan sél épitél dina peujit leutik.Pikeun leuwih hadé adaptasi jeung lingkungan sarta ngaronjatkeun pathogenicity maranéhanana, G. duodenalis trophozoites ngembangkeun hiji struktur cytoskeletal unik diwangun ku 8 flagella, 1 awak tengah, sarta 1 disc véntral [14].Trofozoit Giardia duodenum ngagunakeun sitoskeletonna pikeun nembus peujit leutik luhur, utamana duodenum, sarta ngagantelkeun kana enterosit.Aranjeunna terus-terusan migrasi sareng ngagantelkeun kana sél épitél nganggo métabolisme sél.Ku alatan éta, aya hubungan anu caket antara sitoskeleton sareng virulensina.Giardines husus pikeun Giardia duodenum mangrupakeun komponén tina struktur sitoskeleton [15] sarta dibagi kana opat kelas: α-, β-, γ-, jeung δ-giardines.Aya 21 anggota kulawarga α-giardin, anu sadayana gaduh kamampuan gumantung kalsium pikeun ngabeungkeut fosfolipid [16].Éta ogé nyambungkeun sitoskeleton kana mémbran sél.Dina individu kalawan diare disababkeun ku G. duodenalis, α-giardins anu kacida dikedalkeun sarta immunoreactive salila inféksi [17].Vaksin heterologous dumasar kana Giardia alfa-1 ditangtayungan tina giardiasis dina mencit sarta calon antigén poténsial pikeun ngembangkeun vaksin [18].Alfa-8 giardin, localized dina mémbran plasma jeung flagella, tapi henteu dina disc véntral, ngaronjatkeun motilitas sarta laju tumuwuhna trophozoites di G. duodenalis [19].Alfa-14 giardin nempel kana struktur microtubule on flagella sarta mangaruhan viability of G. duodenalis [20].Alfa-11 giardine hadir dina kaayaanana sapanjang siklus kahirupan, sarta overexpression alfa-11 giardine Karuksakan G. duodenalis sorangan [21].Tapi, teu écés naha alpha-2 giardine sareng alpha-7.3 giardine ngajaga ngalawan inféksi G. duodenalis sareng mékanisme dasarna.
Dina ulikan ieu, plasmid ekspresi eukariot rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine jeung pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ditransfeksi kana makrofag peritoneal primér beurit pikeun ngaktifkeun host NLRP3.Target Inflammasome lajeng disaring.Urang ogé ditaksir peran tina inflammasome NLRP3 dina pathogenicity of G. duodenalis, ditalungtik naha alfa-2 jeung alfa-7,3 giardines dipicuna aktivasina tina inflammasome NLRP3 in vivo, sarta ditangtukeun yén dua kalungguhan ieu giadines dina pathogenicity of G. duodenalis.Tujuan umum urang éta pikeun ngembangkeun target ngajangjikeun pikeun pencegahan inféksi G. duodenalis.
Jenis liar (WT) C57BL / 6 mencit bikang umur 5-8 minggu dibeuli ti Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Cina).Beurit ngagaduhan aksés gratis kana cai, nampi tuangeun anu disterilisasi sareng disimpen dina siklus lampu / poék 12/12 jam.Saméméh inféksi, mencit narima antibiotik ad libitum dina cai nginum supplemented ampicillin (1 mg/mL), vancomycin (1 mg/mL), jeung neomycin (1.4 mg/mL) (sadayana dibeuli ti Shanghai, Cina, organisme jieunan) [22]. ].].Beurit anu kaleungitan kamampuan tuang sareng nginum salami> 24 jam sareng kaleungitan ≥ 20% beurat awak sacara manusiawi di-euthanized ku dislokasi cervical.
WB G. duodenalis trophozoites (Amérika Tipe Budaya Koléksi, Manassas, AS) anu supplemented kalawan 12.5% ​​sérum bovine fétal (FBS; Unggal Héjo, Zhejiang, Cina) jeung 0.1% bovine bili (Sigma-Aldrich, St. Missouri, AS. ).USA) dina kaayaan mikroaérobik.Trofozoit konfluen dikumpulkeun dina és sareng dialirkeun dina nisbah 1: 4 pikeun réproduksi salajengna.
Kista Giardia duodenum ngainduksi sakumaha ditétélakeun saméméhna [23], trophozoites dipanén dina fase logaritmik lajeng éncér jeung encapsulation inducing medium, pH 7.1 (dirobah TYI-S-33) nepi ka konsentrasi ahir 1 × 106 trophozoites / mL.konsentrasi bili 0,05% sedeng).Trophozoit dibudidayakan dina kaayaan anaérobik dina suhu 37°C nepi ka fase pertumbuhan logaritmik.Ngarobah sedeng pikeun kista inducing sedeng (pH 7,8; ​​dirobah TYI-S-33 sedeng kalawan 1% konsentrasi bili) jeung budaya G. duodenalis dina 37 ° C pikeun 48-96 jam, salila formasi cysts ieu observasi dina mikroskop.Sanggeus lolobana trofozoit geus ngainduksi pikeun ngabentuk kista, campuran budaya ieu dipanén sarta resuspended dina cai deionisasi steril pikeun lyse trophozoites sésana.Cysts diitung sarta disimpen dina 4 ° C pikeun nganalisa saterusna ngaliwatan tube gastric di mencit.
Giardia extracellular vesicles (GEVs) diperkaya sakumaha anu dijelaskeun sateuacana [13].Trophozoit dina fase pertumbuhan logaritmik digantungkeun deui dina médium TYI-S-33 anu dirobih anu disiapkeun ku FBS anu dikurangan exosome (Industri Biologis, Beit-Haemek, Israel) kana konsentrasi akhir 1 × 106 parasit / ml sareng diinkubasi salami 12 jam.diisolasi tina supernatan kultur ku sentrifugasi dina 2000 g salami 10 mnt, 10.000 g salami 45 mnt, sareng 100.000 g salami 60 mnt.Precipitates ieu leyur dina fosfat buffered saline (PBS), diitung maké BCA protéin assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) jeung disimpen dina -80 ° C. atawa dipaké langsung pikeun analisis salajengna.
Makrofag peritoneal beurit primér disiapkeun sakumaha anu dijelaskeun sateuacana [24].Sakeudeung, mencit (yuswa 6-8 minggu) anu nyuntik (intraperitoneally [ip]) kalawan 2.5 ml 2.98% Difco medium thioglycol cair (BD, Franklin Lakes, NJ, AS) jeung fed 3-4 palates.Suspénsi makrofag dikumpulkeun tina rongga beuteung beurit saatos euthanasia sareng disentri 3 kali dina 1000 g salami 10 menit.Sél anu dipanen dideteksi ku flow cytometry ngagunakeun spidol CD11b nepi ka kamurnian sél éta> 98%, lajeng ditambahkeun kana piring kultur sél 6-sumur (4,5 x 106 sél / sumur) sarta inkubasi ku 10% FBS (Bioindustri) dina 37 ° C.jeung 5% CO2.
RNA ieu sasari tina 1 × 107 trophozoites dina 1 ml réagen TRIzol (Vazyme, Nanjing, Cina), DNA génomik ieu sasari tina total G. duodenalis RNA maké MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Cina) jeung DNA komplementer (cDNA) ieu disintésis. ngagunakeun MonScript RTIIII Super Campur (Monad) nurutkeun parentah produsén urang.
Inpo runtuyan CDS pikeun target G. duodenalis gén dicandak ti NCBI GenBank.Anggo Primer 5.0 pikeun ngarancang primer kloning anu mulus khusus pikeun unggal gén target.Primer maju (5′-3′) diwangun ku tilu bagian: runtuyan tumpang tindih jeung vektor linearized pcDNA3.1 (+) EcoRV (TGGTGGAATTTCTGCAGAT) tur mimitian kodon ATG na GNN (lamun dasar kahiji teu G).Hal ieu dilakukeun pikeun ngaronjatkeun efisiensi ekspresi.Salaku tambahan, sahenteuna 16 bp basa gabungan (eusi GC 40–60%/Tm kira-kira 55 °C).Primer sabalikna (5′-3′) diwangun ku dua bagian, runtuyan tumpang tindih jeung EcoRV-linearized vektor pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) jeung dasar gabungan tina sahanteuna 16 bp.(kaasup dua eureun panungtungan).basa) kodon kayaning AA atawa GA pikeun ngidinan plasmid rékombinan pikeun nganyatakeun protéin maranéhanana dilabélan).Runtuyan primer dibéréndélkeun dina Table 1 sarta disintésis ku Kangmet Biotéhnologi Co., Ltd. (Changchun, Cina).
Target anu amplified maké Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, Cina) atanapi Ex-taq (Takara Biomédis Téhnologi [Beijing] Co., Ltd., Beijing, Cina) ngagunakeun disiapkeun G. duodenalis cDNA salaku citakan.Ekspresi eukariot vektor plasmid pcDNA3.1(+) linierisasi ku énzim restriksi EcoRV sareng didéfosforilasi ngagunakeun Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Fragmen pcDNA3.1(+) linierisasi sareng fragmen gén target anu diamplifikasi dimurnikeun nganggo kit purifikasi gél DNA (Tiangen) sareng diukur nganggo Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Fragmén pcDNA3.1(+) jeung unggal fragmen gén target dikombinasikeun deui maké MonClone single assembly cloning mix (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) jeung dikonfirmasi ku DNA sequencing maké Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China)..
Plasmid bébas endotoxin pcDNA3.1 (+) -alpha-2 sareng pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 dihasilkeun nganggo Kit Mini Plasmid SanPrep Endotoxin (Sangon Biotech).Konsentrasi dipertahankeun di luhur 500 ng/µl pikeun mastikeun yén EDTA dina panyangga élusi henteu ngaganggu tés transfeksi.Makrofag peritoneal beurit primér dibudidayakan dina pelat 6 sumur kalayan médium RPMI 1640 lengkep (Industri Biologis) salami 12 jam, teras sél dikumbah 3 kali dina PBS haneut pikeun ngaleungitkeun pénisilin sareng streptomisin, teras dina medium ditambah ku medium lengkep.Plasmid bébas éndotoksin pcDNA3.1 (+) -alpha-2 sareng pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 (2.5 μg) diencerkeun dina 125 μl sedeng sérum réduksi Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Lajeng 5 µl Lipofectamine 2000 réagen transfeksi (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) ieu éncér dina 125 µl low sérum Opti-MEM sedeng.Nyiapkeun kompléx liposom-DNA ku cara nyampur plasmid bébas éndotoksin éncér sareng Lipofectamine 2000 sareng ngantepkeun campuranna nangtung dina suhu kamar salami 5 menit.Mindahkeun kompléx sacara misah ka sél dina unggal sumur sareng aduk lalaunan.Sanggeus 4 jam, media kultur sel diganti ku 2 ml medium RPMI 1640 lengkep jeung kultur dituluykeun salila 24 jam.Médium kultur sél seger ditambahkeun kana sél sareng diinkubasi pikeun sababaraha titik waktos gumantung kana desain assay.
Sampel protéin tina supernatan sareng lisat sél disiapkeun sapertos anu dijelaskeun sateuacana [25].Parameter mindahkeun mémbran pikeun pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-aktin, sarta-tag Nya éta 200 mA / 90 mnt.Pikeun interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, AS), caspase-1 (p20) (Adipogen, Swiss) sareng NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Swiss) sareng 1: 5000 nargétkeun tag-Na (Amylet Scientific, Wuhan, Cina) jeung β-aktin (Proteintech, Wuhan, Cina).
Cross-linking sareng disuccinimide suberate (DSS) dilaksanakeun sakumaha anu dijelaskeun sateuacana [26].Sél dikumbah 3 kali ku PBS tiis tur lengkep lisis ku jarum 27 gauge dina 50 µl panyangga réaksi ASC (pH 8.0) ngandung 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES jeung 125 mM NaHCO3.Campuran disentrifugasi dina 5000 g salami 3 mnt sareng pellet dijahit ku 10 µl DSS (25 mM dina DMSO) sareng 40 µl panyangga réaksi ASC salami 30 menit dina suhu 37 ° C.Saatos sentrifugasi dina 5000 g salila 10 menit, pellet ieu leyur dina leyuran 40 µl réaksi ASC panyangga jeung 10 µl 6x protéin loading panyangga (TransGen, Beijing, Cina), lajeng solusi ieu quenched dina suhu kamar pikeun 15. min., Lajeng kulub 10 menit.Sampel protéin teras ditémbak ku Western blotting nganggo antibodi anti-ASC primér (Wanleibio, Shenyang, China) dina nisbah éncér 1:500.
Saatos prosedur anu dijelaskeun sateuacana [13], supernatan kultur sél dipanén sareng sékrési sitokin pro-radang IL-1β ditangtukeun nganggo mouse IL-1 Beta ELISA kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Ngarobih nilai OD450nm kana konsentrasi protéin nganggo kurva standar IL-1β.
Sél anu dilapis dina panutup panutup dikumbah lembut 3 kali dina PBS haneut, dipasang dina fiksatif sél jaringan (Biosharp, Beijing, China) salami 10 mnt dina suhu kamar (RT), dina 0.1% Triton X-Permeabilize dina 100 (diluted dina PBS; Biosharp. ) salila 20 menit dina suhu kamar jeung blok dina 5% bovine sérum albumin (dina PBS) salila 2 jam dina suhu kamar.Sél teras diinkubasi sapeuting dina suhu 4 ° C kalayan antibodi primér ngalawan ASC (1: 100 éncér) atanapi NLRP3 (1: 100 éncér), masing-masing, sareng Cy3 dilabélan kambing anti kelenci IgG (H + L) (1: 400; EarthOx. , San Fransisco, CA, AS) atanapi FITC-conjugated embe anti mouse IgG (1:400; Earthox) sapeuting dina 37 ° C dina poék salila 1 jam.Inti diwarnaan ku Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, China) salila 5 menit sarta dititénan dina mikroskop fluoresensi (Olympus Corporation, Tokyo, Jepang).
Mencit dibagi kana opat grup (n = 7 dina unggal grup): (i) PBS-diperlakukeun grup kontrol négatip (PBS wungkul; gavage 100 μl / mouse PBS dituturkeun ku suntik intraperitoneal poean 100 μl / mouse PBS 3 jam engké)., terus-terusan salami 7 dinten);(ii) grup kontrol négatip dirawat kalayan inhibitor MCC950 [27] (100 µl / mouse via PBS gavage, 3 jam engké, 10 mg / kg beurat awak [BW] MCC950 [dina PBS] ieu dikaluarkeun intraperitoneally poean, lilana 7 poé);(iii) G. duodenalis grup inféksi kista (1,5 x 106 cysts / mouse ku gavage, 3 jam engké, 100 μl / mouse PBS intraperitoneally dikaluarkeun poean pikeun 7 poé);(IV) G. duodenalis cysts digabungkeun inféksi group MCC950 inhibitor treatment group (1,5 × 106 cysts / mouse via gavage, 10mg / kg beurat awak MCC950 intraperitoneally poean pikeun 7 poé dina 3h).Beurat awak unggal beurit diawaskeun unggal dinten sareng sadaya beurit dieuthanisasi dina dinten ka-7.Dipanén duodenum (panjang 3 cm) ieu potong buah leutik dina 1 ml PBS, cysts ancur sapeuting di PBS dina 4 ° C, sarta G. duodenalis trophozoites.Duodenum seger (panjang 1 cm) diisolasi pikeun pewarnaan hematoxylin sareng eosin (H&E).
Beurit dibagi jadi dua grup: (i) grup kontrol MOCK jeung (ii) grup inhibitor MCC950.Aya lima perlakuan dina unggal grup (n = 7 / grup perlakuan): (i) perlakuan PBS grup kontrol négatip (PBS wungkul; 100 µl / mouse PBS, intramuscular (IM) suntik (tibialis anterior) [28, 29];( ii) pcDNA3.1(+) plasmid grup kontrol négatip (100 µg / mouse DNA, via suntikan intramuscularly); grup diperlakukeun kalayan plasmid pcDNA3.1 (+) -alpha-2 (100 μg / DNA mouse, ku suntikan intramuscular), jeung (v) grup dirawat kalayan plasmid pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 (100 μg / mouse DNA, sanggeus 12 jam petikan, mencit dina grup inhibitor MCC950 narima suntikan intraperitoneal poéan MCC950 (10 mg / kg beurat awak) pikeun 7 poé, sedengkeun mencit dina grup MOCK narima volume sarua perlakuan PBS. Sampel getih éta. dikumpulkeun ti beurit eyeballs sarta ditinggalkeun sapeuting dina 4 ° C sampel Sérum anu diisolasi maké énzim-numbu immunosorbent assay (ELISA) pikeun sarta pangukuran tingkat IL-1β.
Tilu puluh lima mencit dibagi kana lima grup (n = 7 / grup).Grup 1 mangrupikeun grup kontrol négatip anu dirawat ku PBS: mencit nampi 100 μl PBS sacara intramuskular sareng 3 dinten saatosna ku gavage.Grup 2 mangrupakeun grup kontrol positif kainfeksi G. duodenalis cysts: mencit anu nyuntik kalawan 100 μl of PBS, sarta 3 poé sanggeusna 1.5 x 106 cysts / mouse anu nyuntik intragastrially.Grup katilu - imunisasi plasmid sareng pcDNA3.1 (+) dina kombinasi sareng kelompok kontrol pikeun inféksi kista duodenal: mencit nampi 100 μg DNA plasmid pcDNA3.1 (+) (im) sacara lisan, 1.5 × 106 kista / mouse 3 pikeun sababaraha poé.Grup 4 jeung 5 éta rekombinan pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine plasmid atanapi pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 giardine plasmid dina kombinasi kalayan G. duodenalis inféksi kista.Kelompok ékspérimén: mencit nampi 100 µg pcDNA3.1 (+) -giardine plasmid DNA (im), lajeng 3 poé sanggeusna, 1,5 × 106 cysts / mouse anu nyuntik via gavage.Beurat awak unggal mouse ieu diawaskeun sanggeus bubuka kista G. duodenalis ngaliwatan tabung.Duodenum seger dikumpulkeun pikeun pangukuran beban parasit sareng analisa pewarnaan HE.
Parobihan histopatologis dianalisis dumasar kana prosedur anu diterbitkeun sateuacana [30].Duodenum seger dibenerkeun ku fiksatif sél jaringan, dipasang dina parafin, dipotong kana bagian 4 μm, diwarnaan ku H&E sareng dianalisis dina mikroskop cahaya.Parobihan patologis perwakilan dina tujuh bagian jaringan tina tujuh beurit mandiri dievaluasi ku ahli patologi anu teu sadar kana perlakuan sareng direbut dina pembesaran 200x.Panjang villi sareng jerona crypts diukur saluyu sareng metode anu dijelaskeun sateuacana.
Hasilna in vitro sareng in vivo dicandak dina rangkep tilu.Grafik dihasilkeun ngagunakeun GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, AS).Bédana antara dua grup dianalisis ku t-test, sedengkeun béda antara ≥3 grup dianalisis ku analisis varian hiji arah (ANOVA) ngagunakeun software SPSS (versi 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, AS).Data dianalisis pikeun homogénitas varian ngagunakeun uji Levene dituturkeun ku tés post hoc Bonferroni (B).Signifikansi dinyatakeun salaku P<0.05, P<0.01, sareng P<0.001 (henteu signifikan [ns]) (P>0.05).
Analisis saméméhna kami ngeunaan proteomics GEV dina Kyoto Encyclopedia of Gén and Génom (KEGG) nunjukkeun yén seueur target tiasa kalibet dina aktivasina jalur sinyal radang [13].Kami milih dua target anu ngajangjikeun, alpha-2 sareng alpha-7.3 giardins, ngagedékeun molekul ieu sareng dianggo pikeun ngawangun pcDNA3.1(+) vektor ekspresi eukariot.Saatos sequencing, rekombinan pcDNA3.1 (+) -alpha-2 sareng alpha-7.3 plasmid ekspresi giardine ditransfeksi kana makrofag peritoneal beurit primér, sareng protéin tanda caspase-1 p20 tina peradangan (fragmen caspase-1 diaktipkeun) diidentifikasi. salaku elucidating molekul konci nu bisa memicu peradangan.Hasilna nunjukkeun yén alpha-2 sareng alpha-7.3 giardines tiasa nyababkeun ekspresi p20 caspase-1 anu sami sareng GEV.Euweuh pangaruh dina aktivasina caspase-1 kapanggih dina kontrol négatip untreated (ngan PBS) jeung kontrol plasmid pcDNA3.1 (+) (Gambar 1).
Ukur aktivasina p20 caspase-1 ku pcDNA3.1 (+) -alpha-2 sareng alpha-7.3 giardins.Plasmid ekspresi eukariot rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 jeung alpha-7.3 giardines (di luhur unggal jalur) ditransfeksi kana makrofag peritoneal beurit primér jeung supernatan kultur dipanen 24 jam saterusna.Western blotting ieu dipaké pikeun ngukur tingkat éksprési tina signature caspase-1 p20 protéin inflammasome.Grup perlakuan PBS-hijina (jalur C) jeung grup monoterapi pcDNA3.1 (+) (jalur pcDNA3.1) dipaké salaku kontrol négatip, sarta grup perlakuan GEV dipaké salaku kontrol positif.Ekspresi protéin rékombinan dikonfirmasi ku ngadeteksi tag histidine dina unggal protéin, sareng pita protéin anu dipiharep nyaéta alpha-2 giardine (38.2 kDa) sareng alpha-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, Giardia duodenum vesikel ekstraseluler, pcDNA3.1(+), vektor EcoRV-linier, SUP, supernatan
Pikeun nangtukeun naha alfa-2 giardine na alfa-7.3 giardine ngainduksi p20 caspase-1 ekspresi sarta maénkeun peran dina ngaktipkeun host NLRP3 réspon radang, pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine na pcDNA3.1 (+) -alpha -7.3 giardin ditransfeksi kana makrofag peritoneal beurit primér sareng DNA plasmid rékombinan, sareng tingkat ekspresi, lokalisasi, sareng oligomerisasi protéin radang konci NLRP3 ditangtukeun.Dina percobaan ieu, GEV dipaké salaku grup kontrol positif, sarta grup euweuh perlakuan (PBS wungkul) atawa pcDNA3.1 (+) grup perlakuan transfection nyaéta grup négatip.Hasilna nunjukkeun yén, sapertos dina grup GEV, DNA plasmid rekombinan tina giardin pcDNA3.1 (+) -alpha-2 sareng giardin pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 nyababkeun upregulation of NLRP3, pro-IL-1β sareng procaspase-1 jeung caspase-1 aktivasina (Gbr. 2a).Sajaba ti éta, duanana giardines ngainduksi signifikan IL-1β sékrési (pcDNA3.1: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alfa-7.3 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P <0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Gambar 2b).Paling protéin ASC éta monomeric dina grup no-perlakuan atawa dina grup perlakuan transfected kalawan pcDNA3.1 (+) plasmid, kontras jeung pcDNA3.1 (+) -alpha-2 atanapi pcDNA3.1 (+) -alpha- 7.3 giardina.Oligomerization ASC lumangsung dina DNA plasmid rékombinan tina grup kontrol positif GEV atawa grup, némbongkeun hiji formulir oligomeric (Gambar 2c).Data awal ieu nunjukkeun yén alpha-2 giardine sareng alpha-7,3 giardine tiasa nyababkeun aktivasina peradangan NLRP3.Studi immunofluorescent saterusna tina lokalisasi ASC na NLRP3 némbongkeun yén dina grup kontrol négatip, protéin ASC ieu sumebar di sakuliah sitoplasma sarta mucunghul salaku sinyal titik kana stimulasi pcDNA3.1 (+) -alpha-2 kalawan giardine atanapi pcDNA3.1 (+) -alfa-7,3 grup giardine atanapi GEV grup kontrol positif (Gambar 2d).Dina kontrol négatip jeung grup pcDNA 3.1 plasmid-diperlakukeun, sinyal protéin NLRP3 teu kauninga, bari titik sinyal fluoresensi dina respon kana pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine atanapi pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 ieu kauninga..giardine kapanggih dina sitoplasma atawa kana stimulasi HEV (Gbr. 2e).Data ieu salajengna demonstrate yén G. duodenalis giardin alfa-2 jeung giardin alfa-7.3 ngaktipkeun NLRP3 inflammasome dina makrofag peritoneal primér mouse.
pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardin sareng pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 giardin ngaktifkeun radang NLRP3 dina makrofag peritoneal beurit.Transfeksi plasmid ekspresi eukariot rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin jeung pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin kana makrofag peritoneal murine primér jeung sél, atawa panén supernatan dina 24 h pikeun analisis éksprési, oligomerization , sékrési.sareng lokalisasi protéin radang konci.Grup PBS-hijina (C) jeung pcDNA3.1 (+) grup perlakuan tunggal dipaké salaku kontrol négatip, sarta grup perlakuan GEV dipaké salaku grup positif.Protéin radang konci NLRP3, kalebet NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, sareng p20 caspase-1, dideteksi ku Western blotting.b Tingkat sékrési IL-1β dina supernatan ditangtukeun maké Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA).Béda antara kelompok kontrol jeung ékspérimén dianalisis ku analisis varian hiji arah (ANOVA) ngagunakeun software SPSS versi 22.0.Tanda bintang nunjukkeun béda anu signifikan antara grup ** P <0.01 jeung *** P <0.001.c tingkat oligomerization ASC dina pellets ditangtukeun ku analisis cross-linking DSS, bari tingkat ASC dina lysates sél dipaké salaku kontrol loading.d Visualisasi lokalisasi ISC ngagunakeun immunofluorescence.e Immunofluorescence ieu dipaké pikeun visualize lokalisasi NLRP3.ASC, apoptosis spék protéin;IL, interleukin;NLRP3, nukléotida-ngabeungkeut oligomerization-kawas reséptor 3;ns, teu signifikan (P > 0,05)
Duanana G. duodenalis jeung GEVs eta secretes ngaktipkeun NLRP3 inflammasome tur ngatur réspon radang host in vitro.Ku kituna, peran tina inflammasome NLRP3 dina pathogenicity of G. duodenalis tetep can écés.Pikeun nalungtik masalah ieu, urang dirancang hiji percobaan antara beurit kainfeksi kista G. duodenalis jeung beurit kainfeksi kista G. duodenalis + perlakuan inhibitor MCC950 tur dibandingkeun éksprési inflammasome NLRP3 lamun kainfeksi kista G. duodenalis.Skéma detil percobaan dipidangkeun dina Gbr. 3a.Parobahan dina beurat awak mencit dina grup perlakuan béda anu diawaskeun pikeun 7 poé sanggeus inféksi jeung cysts, sarta hasilna ditémbongkeun dina Gbr. 3b.Dibandingkeun jeung grup diperlakukeun kalayan PBS murni, hasil némbongkeun yén (i) beurat awak mencit kainfeksi kista G. duodenalis turun ti dinten 3 nepi ka poé 7 sanggeus inféksi;(ii) perlakuan jeung inhibitor MCC950 teu boga pangaruh signifikan dina beurat awak beurit..Dibandingkeun sareng grup inféksi tunggal, BW tina grup inféksi duodenal anu dirawat ku MCC950 turun ka derajat anu béda-béda (Dinten 1: ANOVA, F (3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Dinten 2: ANOVA, F (3, 24). ) = 0,4602, P <0,0001; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; Poé 6: ANOVA, F (3, 24) = 5,457, P = 0,0175;Data ieu nunjukkeun yén inflammasome NLRP3 ngajaga beurit tina leungitna beurat anu signifikan dina tahap awal (2-4 dinten) inféksi duodenal.Urang lajeng aimed pikeun ngadeteksi G. duodenalis trophozoites dina cairan lavage duodenal sarta hasilna ditémbongkeun dina Gambar 3c.Dibandingkeun jeung grup inféksi kista G. duodenalis, jumlah trophozoites dina duodenum nyata ngaronjat sanggeus blocking nu inflammasome NLRP3 (t (12) = 2,902, P = 0,0133).Jaringan duodenal anu diwarnaan ku HE nunjukkeun, dibandingkeun sareng kontrol négatip anu dirawat ku PBS sareng MCC950 nyalira: ​​(i) Inféksi kista G. duodenalis nyababkeun karusakan kana villi duodenal (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0488 ) sarta crypt atrophy (ANOVA, F (3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenum ti beurit kainfeksi kista G. duodenalis tur dirawat kalayan sambetan MCC950.villi duodenal ruksak tur maot (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) kalawan atrophy na crypt branching (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Gbr. 3d- f).Hasil ieu nunjukkeun yén inflammasome NLRP3 muterkeun hiji peran dina ngurangan pathogenicity of G. duodenalis.
Peran NLRP3 inflammasome dina inféksi Giardia duodenum.Beurit anu gavaged (iv) kalawan cysts duodenococcal lajeng dirawat kalayan atawa tanpa MCC950 (ip).Grup perlakuan tunggal sareng PBS atanapi MCC950 dianggo salaku kontrol.Grup ékspérimén sareng regimen perlakuan.b. Beurat awak mencit dina unggal kelompok perlakuan diawaskeun salila 7 poé.Beda antara grup inféksi G. duodenalis jeung grup perlakuan inféksi G. duodenalis + MCC950 dianalisis ku t-test ngagunakeun software SPSS versi 22.0.Tanda bintang nunjukkeun béda anu signifikan dina * P <0.05, ** P <0.01, atawa *** P <0.001.c Beban parasit ditangtukeun ku cacah jumlah trofozoit dina cairan lavage duodenal.Beda antara grup inféksi G. duodenalis jeung grup perlakuan inféksi G. duodenalis + MCC950 dianalisis ku t-test ngagunakeun software SPSS versi 22.0.Tanda bintang nunjukkeun béda anu signifikan dina *P <0.05.d Hematoxylin jeung eosin (H&E) hasil ngawarnaan histopatologi duodenum.Panah beureum nunjukkeun ruksakna villi, panah héjo nunjukkeun karuksakan kana crypts.Skala bar: 100 µm.e, f Analisis statistik jangkungna villus duodenal jeung jangkungna crypt mouse.Tanda bintang nunjukkeun béda anu signifikan dina *P<0.05 sareng **P<0.01.Hasilna dicandak tina 7 percobaan biologis mandiri.BW, beurat awak;ig, jalur pangiriman intragastric;ip, jalur pangiriman intraperitoneal;ns, teu signifikan (P> 0,05);PBS, fosfat buffered saline;WT, tipe liar
Sékrési IL-1β mangrupikeun ciri tina aktivasina peradangan.Pikeun nangtukeun naha G. duodenalis alfa-2 giardine na alfa-7.3 giardine ngaktifkeun NLRP3 host inflammasome in vivo, kami dipaké untreated WT mencit (grup syam) jeung NLRP3 inflammasome-diblokir beurit (MCC950 dipeungpeuk perlakuan group).A skéma detil percobaan ditémbongkeun dina Gbr. 4a.Grup ékspérimén diwangun ku beurit dirawat kalayan PBS, G. duodenalis perlakuan kista ku gavage, suntik intramuscular of pcDNA3.1, sarta suntik intramuscular of pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine atanapi pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Dina dinten ka-7 saatos administrasi intramuskular plasmid rekombinan, sérum dikumpulkeun sareng tingkat IL-1β dina unggal grup ditangtukeun.Ditémbongkeun saperti dina Gambar 4b, dina grup MOCK: (i) dibandingkeun jeung grup PBS, perlakuan pcDNA3.1 teu boga pangaruh signifikan dina sékrési IL-1β (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), kumaha oge, sékrési IL-β ieu nyata elevated dina G. duodenalis group kista (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine na pcDNA3.1- Intramuscular suntik alfa-7.3 giardine nyata ngaronjat tingkat sérum IL-1β (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P <0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine ngainduksi tingkat luhur sékrési IL-1β dina grup suntikan intramuscular giardine pcDNA3.1-alpha-2 (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Dibandingkeun jeung unggal grup dina grup perlakuan MCC950 jeung grup MOCK: (i) tingkat sékrési IL-1β dina grup kontrol PBS jeung grup kontrol pcDNA3.1 turun ka extent tangtu sanggeus blocking inhibitor MCC950, tapi bédana henteu. signifikan (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) sanggeus blocking MCC950., sékrési IL-1β ieu nyata ngurangan di grup G. duodenalis kista-kainféksi, pcDNA3.1-alpha-2 grup giardine, sarta pcDNA3.1-alpha-7.3 group giardine (G. duodenalis: ANOVA, F (9). , 58) = 3,540, P = 0,0120; ) = 3,540, P = 0,0164).Hasil ieu nunjukkeun yén alfa-2 giardine sareng alpha-7.3 giardine nyapih aktivasina tina inflammasome NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1 (+) -giardines ngaktipkeun NLRP3 host inflammasome in vivo.Mencit diimunisasi (IM) kalayan ekspresi eukariot rekombinan plasmid pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine atanapi pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 giardine lajeng dirawat kalayan MCC950 (ip; MCC950 group) atanapi henteu (grup dummy). ).Grup perlakuan plasmid PBS atanapi pcDNA3.1 (+) dipaké salaku kontrol négatip, G. duodenalis grup perlakuan kista dipaké salaku kontrol positif.Grup ékspérimén sareng regimen perlakuan.b Tingkat sérum IL-1β dina mencit diukur dina dinten 7 ku ELISA assay.Bédana antara grup dina grup MOCK dianalisis ngagunakeun ANOVA hiji arah, sarta béda antara grup MOCK jeung grup MCC950 dianalisis ngagunakeun t-test tina software SPSS versi 22.0.Asterisk nunjukkeun béda anu signifikan antara grup perlakuan dina grup MOCK, * P <0.05 jeung *** P <0.001;tanda dollar ($) nunjukkeun béda anu signifikan antara unggal grup dina grup MOCK jeung grup MCC950 dina P <0,05.Hasil tina tujuh percobaan biologis bebas.abdi, suntikan intramuskular, ns, henteu signifikan (P> 0,05)
Pikeun nalungtik pangaruh alfa-2 jeung alfa-7.3 giardine-dimédiasi aktivasina tina NLRP3 host inflammasome on G. duodenalis infectivity, kami dipaké WT C57BL / 6 mencit sarta nyuntik alfa-2 giardine jeung alfa-7.3 giardine.plasmid ieu nyuntik intramuscularly, sanggeus 3 poé ngaliwatan tabung gastric tina kista G. duodenalis, nu satutasna beurit ieu observasi salila 7 poé.Skéma detil percobaan dipidangkeun dina Gbr. 5a.Beurat awak unggal beurit diukur unggal dinten, sampel jaringan duodenal seger dikumpulkeun dina dinten ka-7 saatos administrasi ngaliwatan tabung gastric, jumlah trofozoit diukur, sareng parobahan histopatologis dititénan.Ditémbongkeun saperti dina Gambar 5b, kalawan ngaronjatna waktu dahar, BW mencit di unggal grup laun ngaronjat.MT beurit mimiti turun dina dinten ka-3 saatos administrasi intragastric kista G. duodenalis, teras ningkat sacara bertahap.Aktivasina tina inflammasome NLRP3 ngainduksi ku suntikan intramuscular of alpha-2 giardine na alpha7.3 giardine nyata attenuated leungitna beurat dina mencit (Day 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Poé 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Poé 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Poé 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; Poé 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Poé 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 Poé 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine , F (4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Poé 4: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.5620, P <0.0001, Poé 5: pcDNA3.1-alfa - 2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Dinten 5: pcDNA3.1-alfa -7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Dinten 6: pcDNA3. alfa-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Poé 6: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dinten 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Dinten 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).Beban parasit ditaksir dina duodenum (Gbr. 5c).Dibandingkeun jeung kontrol positif untreated jeung grup nyuntik kalawan pcDNA3.1 vektor kosong, jumlah G. duodenalis trophozoites ieu nyata ngurangan di grup nyuntik kalawan α-2 giardine na α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha). -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alfa-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P <0.0001).Sajaba ti éta, giardine alfa-7.3 éta leuwih pelindung di mencit ti giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Hasil pewarnaan HE ditunjukkan pada gambar.5d–f.Mencit nyuntik kalawan alfa-2 giardine na alfa-7.3 giardine miboga lesions jaringan duodenal pangsaeutikna, manifested ku ruksakna villus, dibandingkeun jeung mencit nyuntik kalawan G. duodenalis jeung mencit nyuntik kalawan G. duodenalis dina kombinasi kalayan pcDNA3 vektor kosong .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 2.466, P = 0.0035 atanapi P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 2.466, P = 0.0028 atanapi P = 0.0055) sareng ngirangan atrofi crypt (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.470, P = 0.0264 atanapi P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 atanapi P = 0,0191).Hasilna nunjukkeun yén alfa-2 giardine sareng alpha-7,3 giardine ngirangan infectivity G. duodenalis ku ngaktifkeun inflammasome NLRP3 dina vivo.
Peran pcDNA3.1 (+) -giardins dina inféksi G. duodenalis.Mencit diimunisasi (IM) kalawan plasmid ekspresi eukariot rekombinan pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine atawa pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine lajeng ditantang ku G. duodenalis cysts (ig).Grup PBS jeung pcDNA3.1 (+) + grup perlakuan kista duodenal dipaké salaku grup kontrol négatip, sarta grup perlakuan kista duodenal dipaké salaku grup kontrol positif.Grup ékspérimén sareng regimen perlakuan.b The MT mencit di unggal rupa grup perlakuan ieu diawaskeun pikeun 7 poé pos-tantangan.Tanda bintang nunjukkeun béda anu signifikan antara grup dina grup G. duodenalis jeung grup giardine pcDNA3.1 (+) -alpha-2, * P <0.05, ** P <0.01, sarta *** P <0.001;tanda dollar ($) nunjukkeun béda anu signifikan antara unggal grup G. duodenalis na pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 grup jardine, $$ P <0,01 jeung $$$ P <0,001.c Beban parasit ditangtukeun ku cacah jumlah trofozoit dina 1 ml lavage duodenal ti duodenum (panjangna 3 cm) jeung dinyatakeun salaku jumlah parasit per cm duodenum.Beda antara grup inféksi G. duodenalis, grup giardine pcDNA3.1 (+) -alpha-2, sarta grup giardine pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 dianalisis ku hiji arah ANOVA ngagunakeun software SPSS Vérsi 22.0.Tanda bintang nunjukkeun béda anu signifikan dina ** P <0.01 sareng *** P <0.001.d Parobahan histopatologis dina duodenum.Panah beureum nunjukkeun ruksakna villi, panah héjo nunjukkeun karuksakan kana crypts.Skala bar: 100 µm.e, f Analisis statistik tina beurit duodenal villus jangkungna (e) jeung jangkungna crypt (f).Béda antara grup dina Gambar 1d dianalisis ku ANOVA saarah ngagunakeun software SPSS versi 22.0.Tanda bintang nunjukkeun béda anu signifikan dina *P<0.05 sareng **P<0.01.Hasil tina tujuh percobaan biologis bebas.ns, teu signifikan (P > 0,05)
Giardia duodenum mangrupikeun parasit peujit manusa sareng mamalia sanés anu nyababkeun giardiasis.Dina 2004, éta kaasup kana WHO Neglected Kasakit Inisiatif alatan Prévalénsi tinggi na leuwih 6 taun, utamana dina komunitas status sosial ékonomi low [32].Sistim imun bawaan muterkeun hiji peran kritis dina respon imun ka inféksi G. duodenalis.Makrofag beurit geus dilaporkeun ka engulf sarta maéhan G. duodenalis ku ngaleupaskeun sarap extracellular [33].studi kami saméméhna geus ditémbongkeun yén G. duodenalis, a parasit extracellular non-invasif, ngaktifkeun p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, sarta NLRP3 jalur signalling radang dina makrofag mouse pikeun ngatur réspon radang host, sarta dileupaskeun GEV bisa ningkatkeun prosés ieu.13], 24].Sanajan kitu, éta PAMPs pasti aub dina peradangan NLRP3 inflammasome-diatur di GEV sarta peran NLRP3 inflammasome di giardiasis tetep bisa elucidated.Pikeun ngabéréskeun dua patarosan ieu, urang ngalaksanakeun kajian ieu.
Inflammasom NLRP3 aya dina sitoplasma sél imun sareng tiasa diaktipkeun ku sababaraha partikel sapertos kristal asam urat, racun, baktéri, virus, sareng parasit.Dina studi baktéri, racun geus diidentifikasi minangka PAMPs konci nu ngaktipkeun sensor radang, anjog ka peradangan jeung pati sél [34].Sababaraha racun sacara struktural, sapertos hemolysin ti Staphylococcus aureus [35] sareng Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) tina enterotoxin (NHE) [37], nyababkeun aktivasina peradangan NLRP3.Panaliti virus nunjukkeun yén protéin virulensi sapertos protéin amplop (E) SARS-COV-2 [38] sareng protéin NS5 virus Zika [39] mangrupikeun PAMP penting anu diakui ku reséptor NLRP3.Dina studi parasit, loba parasit geus dilaporkeun pakait sareng aktivasina inflammasome host, kayaning Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], sarta Leishmania [42].Protéin granula padet GRA35, GRA42, sareng GRA43, pakait sareng virulensi Toxoplasma gondii, diperyogikeun pikeun induksi pyroptosis dina makrofag beurit Lewis [43].Sajaba ti éta, sababaraha studi Leishmania geus fokus kana molekul individu aub dina inflammasome NLRP3, kayaning lipophosphoglycan mémbran parasit [44] atawa séng metalloprotease [45].Di antara kulawarga alfa-giardin annexin-kawas gén, alfa-1 giardin geus ditémbongkeun janten calon vaksin poténsi nyadiakeun panyalindungan ngalawan G. duodenalis dina model mouse [18].Dina ulikan urang, urang milih G. duodenalis virulence faktor alfa-2 jeung alfa-7,3 giardines, nu unik keur giardia tapi rélatif kirang dilaporkeun.Dua gen target ieu diklon kana pcDNA3.1 (+) vektor sistem ekspresi eukariot pikeun analisa aktivasina peradangan.
Dina modél beurit urang, fragmen caspase anu dibeulah janten spidol aktivasina radang.Kana stimulasi, NLRP3 dilibetkeun ku ASC, recruits procaspases, sarta dibangkitkeun caspases aktif nu meulah pro-IL-1β jeung pro-IL-18 kana dewasa IL-1β na IL-18, mungguh -18.Caspases radang (caspases-1, -4, -5 sareng -11) mangrupikeun kulawarga protease sistein anu dilestarikan anu penting pikeun pertahanan bawaan sareng aub dina peradangan sareng maot sél anu diprogram [46].Caspase-1 diaktipkeun ku inflammasomes canonical [47], sedengkeun caspases-4, -5, jeung -11 dibeulah salila formasi inflammasomes atypical [48].Dina ulikan ieu, kami ngagunakeun makrofag peritoneal mouse salaku modél sarta nalungtik p20 caspase-1 dibeulah caspase-1 salaku spidol tina aktivasina peradangan host NLRP3 dina studi ngeunaan inféksi G. duodenalis.Hasilna nunjukkeun yén seueur alfa-giardin anu tanggung jawab pikeun aktivasina peradangan anu khas, anu konsisten sareng kapanggihna molekul virulensi konci anu aub dina baktéri sareng virus.Sanajan kitu, ulikan urang ngan hiji layar awal jeung aya molekul séjén nu bisa ngaktipkeun inflammasomes non-klasik, sakumaha ulikan kami saméméhna kapanggih duanana inflammasomes klasik jeung non-klasik dina inféksi G. duodenalis [13].Pikeun salajengna nangtukeun naha p20 caspase-1 dihasilkeun pakait sareng inflammasome NLRP3, urang transfected alpha-2 jeung alpha-7.3 giardins kana makrofag peritoneal mouse pikeun nangtukeun tingkat ekspresi protéin molekul konci na tingkat oligomerization ASC, confirming yén duanana α-giardins ngaktipkeun. inflammasome NLRP3.Hasilna urang rada béda ti Manko-Prykhoda et al., Anu ngalaporkeun yén stimulasi sél Caco-2 kalayan galur G. muris atanapi E. coli EPEC nyalira tiasa ningkatkeun inténsitas fluoresensi NLRP3, ASC, sareng caspase-1, sanajan teu signifikan, bari kumaha costimulation of G. muris jeung E. coli ngaronjat tingkat tilu protéin [49].Beda ieu bisa jadi alatan béda dina pilihan spésiés Giardia, garis sél, jeung sél primér.Urang ogé dipigawé in vivo assays maké MCC950 di 5-minggu-lami bikang WT C57BL / 6 beurit, nu leuwih rentan ka G. duodenalis.MCC950 mangrupikeun inhibitor NLRP3 molekul leutik anu kuat sareng selektif anu ngahalangan aktivasina NLRP3 kanonik sareng non-kanon dina konsentrasi nanomolar.MCC950 ngahambat aktivasina NLRP3 tapi henteu mangaruhan aktivasina jalur radang AIM2, NLRC4, sareng NLRP1 atanapi jalur sinyal TLR [27].MCC950 meungpeuk aktivasina NLRP3 tapi henteu ngahambat inisiasi NLRP3, K+ efflux, Ca2+ influx, atawa interaksi antara NLRP3 jeung ASC;tibatan, eta nyegah aktivasina inflammasome NLRP3 ku blocking oligomerization ASC [27].Kituna, urang dipaké MCC950 dina ulikan in vivo pikeun nangtukeun peran tina inflammasome NLRP3 sanggeus suntikan giardine.Diaktipkeun caspase-1 p10 cleaves pro-radang cytokines pro-IL-1β sareng pro-IL-18 kana dewasa IL-1β sareng IL-18 [50].Dina ulikan ieu, tingkat sérum IL-1β dina mencit giardine-diperlakukeun kalayan atawa tanpa MCC950 dipaké salaku indikator naha inflammasome NLRP3 diaktipkeun.Sapertos anu dipiharep, perlakuan MCC950 sacara signifikan ngirangan tingkat IL-1β sérum.Data ieu jelas nunjukkeun yén G. duodenalis giardin alfa-2 sareng giardin alfa-7.3 tiasa ngaktipkeun inflammasome mouse NLRP3.
Data signifikan akumulasi leuwih dékade kaliwat geus nunjukkeun yén IL-17A mangrupakeun régulator master of kekebalan ngalawan G. muris, inducing IL-17RA signalling, ngahasilkeun péptida antimikrobial, sarta régulasi aktivasina pelengkap [51].Sanajan kitu, inféksi Giardia lumangsung leuwih remen di sawawa ngora, sarta geus dilaporkeun yén inféksi Giardia di mencit ngora teu ngaktifkeun respon IL-17A pikeun exert éfék pelindung na [52], nyababkeun peneliti néangan Giardia immunomodulatory lianna.mékanisme inféksi helminth.Nu nulis ulikan panganyarna dilaporkeun yén G. muris bisa ngaktipkeun inflammasome NLRP3 ku E. coli EPEC, nu promotes produksi péptida antimikrobial sarta ngurangan kapasitas kantétan sarta jumlah trophozoites dina saluran peujit, kukituna ngurangan severity tina titik. kasakit disababkeun ku bacilli [49].The NLRP3 inflammasome aub dina ngembangkeun sagala rupa panyakit.Studi geus ditémbongkeun yén Pseudomonas aeruginosa micu autophagy dina makrofag pikeun nyegah maot sél, sarta prosés ieu gumantung kana aktivasina tina inflammasome NLRP3 [53].Pikeun N. caninum, aktivasina spésiés-dimédiasi oksigén réaktif tina inflammasome NLRP3 watesan réplikasi na di host, sahingga hiji udagan terapi poténsial [9].Paracoccidioides brasiliensis geus kapanggih mun induksi aktivasina tina inflammasome NLRP3 dina sél déndritik turunan sungsum tulang beurit, hasilna sékrési cytokine radang IL-1β, nu muterkeun hiji peran kritis dina pertahanan host [10].Sababaraha spésiés Leishmania, kaasup L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, sarta L. infantum chagasi, ngaktipkeun NLRP3 na ASC-gumantung caspase-1 dina makrofag, kitu ogé inféksi Leishmania.Réplikasi parasit ditingkatkeun dina mencit kakurangan dina gén NLRP3 / ASC / caspase-1 [11].Zamboni et al.Inféksi Leishmania parantos dilaporkeun nyababkeun aktivasina tina inflammasome NLRP3 dina makrofag, anu ngawatesan réplikasi parasit intrasélular.Ku kituna, Leishmania tiasa ngahambat aktivasina NLRP3 salaku strategi nyingkahan.Dina studi in vivo, inflammasome NLRP3 nyumbang kana ngaleungitkeun Leishmania, tapi henteu mangaruhan jaringan [54].Sabalikna, dina studi helminthiasis, aktivasina tina inflammasome NLRP3 diteken kekebalan pelindung host urang ngalawan helminthiasis cerna [12].Shigella mangrupakeun salah sahiji baktéri utama ngabalukarkeun diare di sakuliah dunya.Baktéri ieu bisa ngainduksi produksi IL-1β ngaliwatan P2X7 reséptor-mediated K+ efflux, spésiés oksigén réaktif, acidification lisosom, jeung karuksakan mitokondria.The NLRP3 inflammasome négatip ngatur fagositosis sarta aktivitas baktéri tina makrofag ngalawan Shigella [55].Studi Plasmodium nunjukkeun yén beurit kakurangan AIM2, NLRP3 atanapi caspase-1 anu kainfeksi Plasmodium ngahasilkeun interferon tipe 1 anu luhur sareng langkung tahan ka inféksi Plasmodium [56].Sanajan kitu, peran alfa-2 giardine na alpha-7.3 giardine di inducing aktivasina pathogenic of peradangan NLRP3 di mencit teu jelas.
Dina ulikan ieu, inhibisi tina inflammasome NLRP3 ku MCC950 ngurangan BW jeung ngaronjat jumlah trophozoites dina cairan lavage peujit dina mencit, hasilna parobahan patologis leuwih parna dina jaringan duodenal.Alpha-2 giardine jeung alpha-7.3 giardine ngaktifkeun host mouse NLRP3 inflammasome, ningkatkeun beurat awak mouse, ngurangan jumlah trophozoites dina cairan lavage peujit, sarta alleviate lesions duodenal patologis.Hasil ieu nunjukkeun yén G. duodenalis tiasa ngaktipkeun inflammasome host NLRP3 via alpha-2 giardine sareng alpha-7,3 giardine, ngirangan patogénitas G. duodenalis dina mencit.
Koléktif, hasil kami demonstrate yén alfa-2 jeung alfa-7.3 giardines dipicuna aktivasina tina NLRP3 host inflammasome sarta ngurangan infectivity of G. duodenalis dina mencit.Ku alatan éta, molekul ieu mangrupa target ngajangjikeun pikeun pencegahan giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: tinjauan.Ieu nembe kaungkap Pat Inflamm alérgi kana ubar.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: tinjauan pharmacotherapy.Pamadegan Ahli tina tukang ubar.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, résistansi ubar sareng panemuan target énggal.Infects Disord target ubar.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, jsb NLRP3 inflammasome sarta panyakit radang.Oksida Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Peran tina inflammasome dina radang peujit jeung kanker.Gastroenterologi.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical na atypical NLRP3 aktivasina inflammasome di crossroads of kasabaran imun jeung peradangan Gut.pra-imun.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-dimédiasi aktivasina inflammasome NLRP3 aub dina respon kana N. inféksi caninum.Vektor parasit.2020;13:449.