Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngajantenkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Toxoplasma gondii mangrupikeun parasit protozoa intrasélular anu ngamodulasi lingkungan mikro host anu katépaan sareng dipikanyaho aya hubunganana sareng insiden pertumbuhan tumor otak.Dina ulikan ieu, urang hipotésis yén exosomal miRNA-21 tina inféksi Toxoplasma promotes tumuwuhna tumor otak.Exosom tina BV2 microglia anu kainféksi Toxoplasma dicirikeun sareng internalisasi sél glioma U87 dikonfirmasi.Profil éksprési microRNA exosomal dianalisis ngagunakeun susunan microRNA sareng microRNA-21A-5p anu aya hubunganana sareng Toxoplasma gondii sareng asihan tumor.Kami ogé nalungtik tingkat mRNA tina gén anu aya hubunganana sareng tumor dina sél glioma U87 ku ngarobih tingkat miR-21 dina exosom sareng pangaruh exosom dina proliferasi sél glioma U87 manusa.Dina exosom sél glioma U87 kainfeksi Toxoplasma gondii, éksprési microRNA-21 ngaronjat sarta aktivitas gén antitumor (FoxO1, PTEN, sarta PDCD4) ngurangan.Exosom turunan BV2 kainfeksi Toxoplasma nyababkeun proliferasi sél glioma U87.Exosom nyababkeun kamekaran sél U87 dina modél tumor beurit.Urang nyarankeun yén ngaronjat exosomal miR-21 dina Toxoplasma-kainféksi BV2 microglia bisa maénkeun peran penting salaku promoter pertumbuhan sél dina sél glioma U87 ku downregulating gén antitumor.
Diperkirakeun langkung ti 18.1 juta kasus kanker maju didiagnosis di sakuliah dunya dina taun 2018, kalayan sakitar 297,000 tumor sistem saraf pusat didiagnosis unggal taun (1.6% tina sadaya tumor)1.Panaliti saméméhna nunjukkeun yén faktor résiko pikeun ngembangkeun tumor otak manusa kalebet rupa-rupa produk kimia, riwayat kulawarga, sareng radiasi pangionan tina alat terapi sareng diagnostik sirah.Sanajan kitu, anu ngabalukarkeun pasti tina malignancies ieu teu kanyahoan.Kira-kira 20% tina sakabeh kangker di sakuliah dunya disababkeun ku agén tepa, kaasup virus, baktéri jeung parasit3,4.Patogén inféksi ngaganggu mékanisme genetik sél host, sapertos perbaikan DNA sareng siklus sél, sareng tiasa nyababkeun peradangan kronis sareng karusakan sistem imun5.
Agen inféksi anu aya hubunganana sareng kanker manusa mangrupikeun patogén virus anu paling umum, kalebet papillomavirus manusa sareng virus hépatitis B sareng C.Parasit ogé bisa maénkeun peran poténsial dina ngembangkeun kanker manusa.Sababaraha spésiés parasit, nyaéta Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis jeung Hymenolepis nana, geus kalibet dina rupa-rupa jenis kanker manusa 6,7,8.
Toxoplasma gondii nyaéta protozoa intrasélular anu ngatur lingkungan mikro sél host anu kainféksi.Parasit ieu diperkirakeun nginféksi kira-kira 30% tina populasi sadunya, nempatkeun sakabéh populasi dina resiko9,10.Toxoplasma gondii bisa nginféksi organ vital, kaasup sistim saraf pusat (SSP), sarta ngabalukarkeun kasakit serius kayaning meningitis fatal jeung encephalitis, utamana dina penderita immunocompromised9.Sanajan kitu, Toxoplasma gondii ogé bisa ngarobah lingkungan tina host kainféksi ku modulating tumuwuhna sél jeung réspon imun dina individu immunocompetent, ngarah kana pangropéa hiji inféksi kronis asimtomatik9,11.Narikna, dibere korelasi antara Prévalénsi T. gondii jeung incidence tumor otak, sababaraha laporan nunjukkeun yén dina vivo parobahan lingkungan host alatan inféksi T. gondii kronis nyarupaan microenvironment tumor.
Exosom katelah komunikator intersélular nu nganteurkeun eusi biologis, kaasup protéin jeung asam nukléat, ti sél tatangga16,17.Exosom tiasa mangaruhan prosés biologis anu aya hubunganana sareng tumor sapertos anti-apoptosis, angiogenesis, sareng metastasis dina lingkungan mikro tumor.Khususna, miRNAs (miRNAs), RNA non-coding leutik panjangna kira-kira 22 nukléotida, nyaéta régulator gén pasca-transkripsi anu penting anu ngadalikeun leuwih ti 30% mRNA manusa ngaliwatan kompleks silencing miRNA-induced (miRISC).Toxoplasma gondii tiasa ngaganggu prosés biologis ku cara ngadalikeun éksprési miRNA dina host anu kainféksi.MiRNA host ngandung sinyal penting pikeun ngatur prosés biologis host pikeun ngahontal strategi survival parasit.Ku kituna, diajar parobahan dina profil miRNA host kana inféksi ku T. gondii bisa mantuan urang ngartos interaksi antara host jeung T. gondii leuwih jelas.Mémang, Thirugnanam et al.15 ngusulkeun yén T. gondii promotes carcinogenesis otak ku cara ngarobah ekspresi na on miRNAs host husus pakait sareng tumuwuhna tumor sarta kapanggih yén T. gondii bisa ngabalukarkeun gliomas dina sato eksperimen.
Ulikan ieu museurkeun kana parobahan exosomal miR-21 dina mikroglia host anu kainfeksi Toxoplasma BV2.Urang niténan peran kamungkinan dirobah exosomal miR-21 dina tumuwuhna sél glioma U87 alatan ingetan dina inti FoxO1 / p27, nu mangrupakeun udagan overexpressed miR-21.
Exosomes diturunkeun tina BV2 dicandak nganggo centrifugation diferensial sareng disahkeun ku sababaraha cara pikeun nyegah kontaminasi sareng komponén sélular atanapi vesikel sanés.SDS-polyacrylamide gél Éléktroforésis (SDS-PAGE) némbongkeun pola béda antara protéin sasari tina sél BV2 na exosomes (Gambar 1A), sarta sampel ditaksir pikeun ayana Alix, nu dianalisis ku Western blotting spidol protéin exosomal di.panyiri Alix kapanggih dina protéin exosome tapi henteu dina protéin lisat sél BV2 (Gbr. 1B).Salaku tambahan, RNA anu dimurnikeun tina exosom anu diturunkeun tina BV2 dianalisis nganggo bioanalyzer.Subunit ribosom 18S sareng 28S jarang dititénan dina pola migrasi RNA exosomal, nunjukkeun purity dipercaya (Gambar 1C).Tungtungna, mikroskop éléktron transmisi némbongkeun yén exosomes observasi éta ngeunaan 60-150 nm dina ukuran sarta miboga struktur cup-kawas has morfologi exosome (Gbr. 1D).
Karakterisasi éksosom diturunkeun tina sél BV2.(A) Kaca lambar data kaamanan.Protéin diisolasi tina sél BV2 atanapi éksosom diturunkeun tina BV2.Pola protéin béda antara sél sareng éksosom.(B) analisis Western blot tina hiji spidol exosomal (Alix).(C) Evaluasi RNA dimurnikeun tina sél BV2 sareng exosom turunan BV2 nganggo bioanalyzer.Ku kituna, subunit ribosom 18S jeung 28S dina sél BV2 jarang kapanggih dina RNA exosomal.(D) Transmisi mikroskop éléktron némbongkeun yén exosomes diisolasi tina sél BV2 anu négatip patri ku 2% uranyl asétat.Exosomes kira-kira 60-150 nm dina ukuran sarta cup-ngawangun (Song jeung Jung, data unpublished).
Internalisasi sélular tina exosom turunan BV2 kana sél glioma manusa U87 dititénan nganggo mikroskop confocal.PKH26 dilabélan exosom dilokalisasi dina sitoplasma sél U87.Inti diwarnaan ku DAPI (Gbr. 2A), nunjukkeun yén exosom turunan BV2 tiasa internalisasi ku sél host sareng pangaruh lingkungan sél panarima.
Internalisasi exosom turunan BV2 kana sél glioma U87 sareng exosom turunan BV2 kainfeksi Toxoplasma RH ngainduksi proliferasi sél glioma U87.(A) Exosomes engulfed ku sél U87 diukur ku mikroskop confocal.Sél glioma U87 diinkubasi ku exosom dilabélan ku PKH26 (beureum) atanapi tanpa kontrol salami 24 jam.Inti diwarnaan ku DAPI (biru) teras dititénan dina mikroskop confocal (bar skala: 10 μm, x 3000).(B) U87 proliferasi sél glioma ditangtukeun ku assay proliferasi sél.Sél glioma U87 dirawat kalayan exosom pikeun waktos anu dituduhkeun. *P <0,05 dicandak ku uji t Student. *P <0,05 dicandak ku uji t Student. *P <0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P <0,05 ku uji-t Siswa. *P <0.05 通过学生t 检验获得。 * P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 dimeunangkeun ngagunakeun uji-t Student.
Saatos ngonfirmasi internalisasi exosom turunan BV2 kana sél glioma U87, kami ngalaksanakeun tés proliferasi sél pikeun nalungtik peran exosom turunan Toxoplasma turunan BV2 dina pamekaran sél glioma manusa.Perlakuan sél U87 kalawan exosomes ti T. gondii-kainféksi sél BV2 némbongkeun yén T. gondii-kainféksi BV2-turunan exosomes disababkeun proliferasi nyata luhur sél U87 dibandingkeun kontrol (Gbr. 2B).
Sajaba ti éta, tumuwuhna sél U118 miboga hasil sarua salaku U87, sakumaha Toxoplasma dirangsang exosomes ngabalukarkeun tingkat pangluhurna proliferasi (data teu ditémbongkeun).Dumasar kana data ieu, urang tiasa nunjukkeun yén exosom anu kainféksi Toxoplasma turunan BV2 maénkeun peran anu penting dina proliferasi sél glioma.
Pikeun nalungtik pangaruh exosom turunan BV2 anu kainféksi Toxoplasma dina kamekaran tumor, kami nyuntik sél glioma U87 kana beurit buligir pikeun modél xenograft sareng nyuntik exosom turunan BV2 atanapi exosom turunan BV2 anu kainféksi RH.Saatos tumor janten katingali saatos 1 minggu, unggal kelompok ékspérimén 5 mencit dibagi dumasar kana ukuran tumor pikeun nangtukeun titik awal anu sami, sareng ukuran tumor diukur salami 22 dinten.
Dina mencit kalawan modél xenograft U87, ukuran tumor nyata leuwih badag sarta beurat anu dititénan dina BV2-turunan RH-kainféksi grup exosome dina dinten 22 (Gbr. 3A, B).Di sisi séjén, teu aya béda anu signifikan dina ukuran tumor antara grup exosome turunan BV2 jeung grup kontrol sanggeus perlakuan exosome.Sajaba ti éta, mencit nyuntik sél glioma na exosomes visually ditampilkeun volume tumor pangbadagna di grup RH-kainféksi BV2-turunan exosomes (Gbr. 3C).Hasil ieu nunjukkeun yén exosom anu kainféksi Toxoplasma turunan BV2 nyababkeun kamekaran glioma dina modél tumor beurit.
Oncogenesis (AC) tina exosomes turunan BV2 dina modél mouse xenograft U87.Ukuran tumor (A) sareng beurat (B) ningkat sacara signifikan dina beurit buligir BALB / c anu dirawat kalayan exosom anu kainféksi RH diturunkeun tina BV2.BALB / c mencit buligir (C) anu nyuntik subcutaneously kalawan 1 x 107 sél U87 ditunda dina campuran Matrigel.Genep dinten saatos suntikan, 100 μg exosom turunan BV2 dirawat di mencit.Ukuran sareng beurat tumor diukur dina dinten anu dituduhkeun sareng saatos kurban masing-masing. * P <0,05. * P <0,05. *Р <0,05. * P <0,05. * P <0.05. * P <0.05. *Р <0,05. * P <0,05.
Data némbongkeun yén 37 miRNAs (16 overexpressed na 21 downexpressed) pakait sareng kawedukan atawa ngembangkeun tumor anu nyata dirobah dina microglia sanggeus inféksi jeung galur Toxoplasma RH (Gbr. 4A).Tingkat éksprési rélatif miR-21 diantara miRNA anu dirobih dikonfirmasi ku RT-PCR sacara real-time dina exosom diturunkeun tina BV2, exosom dirawat kalayan sél BV2 sareng U87.Ekspresi miR-21 nunjukkeun paningkatan anu signifikan dina exosom tina sél BV2 anu kainfeksi Toxoplasma gondii (galur RH) (Gbr. 4B).Tingkat éksprési relatif miR-21 dina sél BV2 na U87 ngaronjat sanggeus uptake of exosomes dirobah (Gbr. 4B).Tingkat rélatif ekspresi miR-21 dina jaringan otak pasien tumor sareng mencit anu kainfeksi Toxoplasma gondii (galur ME49) langkung luhur tibatan kontrol masing-masing (Gbr. 4C).Hasil ieu pakait sareng bédana antara tingkat éksprési mikroRNA anu diprediksi sareng dikonfirmasi in vitro sareng in vivo.
Parobahan ekspresi exosomal miP-21a-5p dina microglia kainfeksi Toxoplasma gondii (RH).(A) Némbongkeun parobahan signifikan dina siRNA pakait sareng kawedukan atawa ngembangkeun tumor handap T. gondii inféksi RH.(B) Tingkat éksprési miR-21 relatif dideteksi ku RT-PCR sacara real-time dina exosom turunan BV2, exosom anu dirawat BV2, sareng sél U87.(C) Tingkat éksprési miR-21 rélatif kapanggih dina jaringan otak pasien tumor (N = 3) sareng beurit anu kainfeksi Toxoplasma gondii (galur ME49) (N = 3). *P <0,05 dicandak ku uji t Student. *P <0,05 dicandak ku uji t Student. *P <0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0,05 dicandak ngagunakeun uji-t Student. *P <0.05 通过学生t 检验获得。 * P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 dimeunangkeun ngagunakeun uji-t Student.
Exosom tina sél BV2 anu kainféksi RH nyababkeun tumuwuhna glioma in vivo sareng in vitro (Gbr. 2, 3).Pikeun ngadeteksi mRNA anu relevan, urang nalungtik tingkat mRNA gén target antitumor, kotak forkhead O1 (FoxO1), PTEN, sareng maot sél diprogram 4 (PDCD4) dina sél U87 anu katépaan ku exosom diturunkeun tina BV2 atanapi RH BV2.Analisis bioinformatics nunjukkeun yén sababaraha gén anu aya hubunganana sareng tumor, kalebet gén FoxO1, PTEN, sareng PDCD4, gaduh situs beungkeutan miR-2121,22.Tingkat mRNA gén target antitumor diréduksi dina exosom turunan BV2 anu kainféksi RH dibandingkeun sareng exosom turunan BV2 (Gbr. 5A).FoxO1 némbongkeun ngurangan tingkat protéin dina exosomes BV2-katépa RH-diturunkeun dibandingkeun exosomes BV2-turunan (Gambar 5B).Dumasar kana hasil ieu, urang tiasa mastikeun yén exosom anu diturunkeun tina BV2 anu katépaan RH ngirangan régulasi gén anti-onkogenik, ngajaga peranna dina kamekaran tumor.
Toxoplasma RH-kainféksi BV2-turunan exosomes induksi suprési gén antitumor dina U87 sél glioma ku Toxoplasma RH-kainféksi BV2-turunan exosomes.(A) Real-time PCR of FoxO1, PTEN na PDCD4 éksprési dina exosomes diturunkeun tina T. gondii RH-kainféksi BV2 dibandingkeun exosomes PBS.β-aktin mRNA dipaké salaku kontrol a.(B) éksprési FoxO1 ditangtukeun ku Western blotting na densitometry data anu dievaluasi statistik ngagunakeun program ImageJ. *P <0,05 dicandak ku uji t Student. *P <0,05 dicandak ku uji t Student. *P <0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0,05 dicandak ngagunakeun uji-t Student. *P <0.05 通过学生t 检验获得。 * P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 dimeunangkeun ngagunakeun uji-t Student.
Pikeun ngartos pangaruh miP-21 dina exosom dina régulasi gén anu aya hubunganana sareng tumor, sél U87 ditransféksi ku inhibitor miP-21 nganggo Lipofectamine 2000 sareng sél dipanén 24 jam saatos transfeksi.Tingkat ekspresi FoxO1 sareng p27 dina sél anu ditransféksi ku sambetan miR-21 dibandingkeun sareng sél anu dirawat ku exosomes turunan BV2 nganggo qRT-PCR (Gbr. 6A,B).Transfection tina inhibitor miR-21 kana sél U87 nyata downregulated FoxO1 na p27 ekspresi (Gbr. 6).
RH-kainféksi exosomal BV2-turunan miP-21 dirobah ekspresi FoxO1 / p27 dina sél glioma U87.Sél U87 ditransféksi ku inhibitor miP-21 nganggo Lipofectamine 2000 sareng sél dipanén 24 jam saatos transfeksi.Tingkat ekspresi FoxO1 sareng p27 dina sél anu ditransféksi ku sambetan miR-21 dibandingkeun sareng tingkat sél anu dirawat ku exosom turunan BV2 nganggo qRT-PCR (A, B).
Pikeun kabur tina réspon imun host, parasit Toxoplasma robah jadi kista jaringan.Aranjeunna parasitize rupa jaringan, kaasup otak, jantung, jeung otot rangka, sapanjang hirupna host sarta modulate respon imun host urang.Salaku tambahan, aranjeunna tiasa ngatur siklus sél sareng apoptosis sél host, ngamajukeun proliferasina14,24.Toxoplasma gondii utamana nginféksi sél déndritik inangna, neutrofil, jeung garis keturunan monosit/makrofag, kaasup mikroglia otak.Toxoplasma gondii nyababkeun diferensiasi makrofag tina phenotype M2, mangaruhan penyembuhan tatu saatos inféksi patogén, sareng ogé aya hubunganana sareng hypervascularization sareng fibrosis granulomatous.Patogenesis paripolah inféksi Toxoplasma ieu tiasa aya hubunganana sareng spidol anu aya hubunganana sareng kamekaran tumor.Lingkungan mumusuhan diatur ku Toxoplasma bisa nyarupaan precancer pakait.Ku alatan éta, bisa dianggap yén inféksi Toxoplasma kedah nyumbang kana ngembangkeun tumor otak.Nyatana, tingkat luhur inféksi Toxoplasma parantos dilaporkeun dina sérum pasien kalayan sagala rupa tumor otak.Sajaba ti éta, Toxoplasma gondii bisa jadi éféktor karsinogenik sejen tur meta sinergis pikeun mantuan carcinogens tepa séjén ngamekarkeun tumor otak.Dina hal ieu, eta sia noting yén P. falciparum jeung virus Epstein-Barr synergistically nyumbang kana formasi lymphoma Burkitt urang.
Peran exosomes salaku régulator dina widang panalungtikan kanker parantos ditalungtik sacara éksténsif.Sanajan kitu, peran exosome antara parasit jeung host kainféksi tetep kirang dipikaharti.Sajauh ieu, sagala rupa régulator, kaasup protéin disékrésikeun, geus ngajelaskeun prosés biologis ku parasit protozoa nolak serangan host sarta perpetuate inféksi.Anyar-anyar ieu, aya konsép anu ngembang yén microvesicles anu aya hubunganana sareng protozoa sareng microRNAs berinteraksi sareng sél host pikeun nyiptakeun lingkungan anu nguntungkeun pikeun kasalametanna.Ku alatan éta, studi salajengna diperlukeun pikeun manggihan hubungan antara miRNAs exosomal dirobah sarta proliferasi sél glioma.Robah MicroRNA (gén klaster miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 sareng miR-17-92) ngiket kana promotor STAT3 dina makrofag manusa anu katépaan toxoplasma, diatur sareng ngainduksi anti -apoptosis salaku respon kana inféksi Toxoplasma gondii 29.Inféksi Toxoplasma ngaronjatkeun ekspresi miR-17-5p jeung miR-106b-5p, nu pakait jeung sababaraha kasakit hyperproliferative 30 .Data ieu nunjukkeun yén host miRNAs diatur ku inféksi Toxoplasma mangrupakeun molekul penting pikeun survival parasit jeung pathogenesis dina kabiasaan biologis host.
MiRNAs anu dirobih tiasa mangaruhan sababaraha jinis paripolah nalika ngamimitian sareng kamajuan sél ganas, kalebet gliomas: swasembada sinyal pertumbuhan, teu sensitipitas kana sinyal ngahambat pertumbuhan, ngajauhan apoptosis, poténsi réplika anu henteu terbatas, angiogenesis, invasi sareng metastasis, sareng peradangan.Dina glioma, miRNA anu dirobih parantos diidentifikasi dina sababaraha studi profil ekspresi.
Dina ulikan ayeuna, urang dikonfirmasi tingkat luhur miRNA-21 éksprési dina sél host toxoplasma-kainféksi.miR-21 geus diidentifikasi minangka salah sahiji microRNAs paling sering overexpressed dina tumor padet, kaasup gliomas, 33 sarta éksprési na correlates jeung kelas glioma.Kumpulkeun bukti nunjukkeun yén miR-21 mangrupikeun onkogén novél anu bertindak salaku faktor anti-apoptosis dina kamekaran glioma sareng diekspresikeun pisan dina jaringan sareng plasma tina malignancies otak manusa.Narikna, inactivation miR-21 dina sél glioma sareng jaringan micu inhibisi proliferasi sél kusabab apoptosis gumantung ka caspase.Analisis bioinformatic tina target prediksi miR-21 ngungkabkeun sababaraha gen suppressor tumor anu aya hubunganana sareng jalur apoptosis, kalebet maot sél anu diprogram 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN, sareng kotak forkhead O1 (FoxO1), kalayan situs beungkeutan miR-2121..22.38.
FoxO1, salaku salah sahiji faktor transkripsi (FoxO), aub dina ngembangkeun rupa-rupa jenis kanker manusa sarta bisa ngatur ekspresi gén suppressor tumor kayaning p21, p27, Bim, sarta FasL40.FoxO1 tiasa ngabeungkeut sareng ngaktipkeun sambetan siklus sél sapertos p27 pikeun ngahambat pertumbuhan sél.Sumawona, FoxO1 mangrupikeun éféktor konci sinyal PI3K / Akt sareng ngatur seueur prosés biologis sapertos kamajuan siklus sél sareng diferensiasi sél ngaliwatan aktivasina transkripsi p2742.
Dina kacindekan, urang yakin yén exosomal miR-21 diturunkeun tina microglia Toxoplasma-kainféksi bisa maénkeun peran penting salaku regulator tumuwuhna sél glioma (Gbr. 7).Tapi, studi satuluyna diperlukeun pikeun manggihan tumbu langsung antara exosomal miR-21, inféksi Toxoplasma dirobah, sarta pertumbuhan glioma.Hasil ieu diperkirakeun nyadiakeun titik awal pikeun nalungtik hubungan antara inféksi Toxoplasma jeung incidence of glioma.
Diagram skéma tina mékanisme karsinogenesis glioma (otak) diusulkeun dina ulikan ieu.Panulis ngagambar dina PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Sadaya protokol ékspérimén dina ulikan ieu, kalebet pamakean sato, saluyu sareng Pedoman Etika Standar Universitas Nasional Seoul Perawatan Sato sareng Komite Pamaké sareng disatujuan ku Dewan Tinjauan Institusi Sakola Kedokteran Universitas Nasional Seoul (nomer IRB SNU- 150715).-2).Sadaya prosedur ékspérimén dilaksanakeun saluyu sareng saran ARRIVE.
BV2 mouse microglia sareng sél glioma manusa U87 dibudidayakan di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) sareng Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), masing-masing ngandung 10% sérum bovine fetal, 4 mM l- glutamine, 0,2 mM pénisilin jeung 0,05 mM streptomycin.Sél dibudidayakeun dina inkubator kalayan 5% CO2 dina suhu 37 ° C.Garis sél glioma sanés, U118, dianggo pikeun ngabandingkeun sareng sél U87.
Pikeun ngasingkeun exosomes ti T. gondii-kainféksi RH na ME49 galur, T. gondii tachyzoites (galur RH) anu dipanén tina rongga beuteung tina 6-minggu-lami BALB / c mencit nyuntik 3-4 poé saméméh.Tachyzoites dikumbah tilu kali kalayan PBS sarta dimurnikeun ku centrifugation dina 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AS)43.Pikeun ménta tachyzoites tina galur ME49, BALB / c mencit anu intraperitoneally nyuntik kalawan 20 cysts jaringan sarta transformasi tachyzoite di cysts ieu dikumpulkeun ku ngumbah rohangan beuteung dina dinten 6-8th sanggeus inféksi (PI).Beurit kainfeksi PBS.ME49 tachyzoites anu tumuwuh dina sél supplemented kalawan 100 μg / ml pénisilin (Gibco / BRL, Grand Island, NY, AS), 100 μg / ml streptomycin (Gibco / BRL), sarta 5% sérum bovine fétus (Lonza, Walkersville, MD) .., AS) dina 37 °C jeung 5% karbon dioksida.Saatos budidaya dina sél Vero, ME49 tachyzoites dialirkeun dua kali ngaliwatan jarum 25 gauge lajeng ngaliwatan saringan 5 μm pikeun miceun lebu jeung sél.Saatos ngumbah, tachyzoites digantungkeun deui dina PBS44.Kista jaringan Toxoplasma gondii galur ME49 dijaga ku suntikan intraperitoneal kista anu diisolasi tina otak beurit C57BL / 6 anu kainféksi (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Otak beurit anu kainféksi ME49 dipanén saatos 3 bulan PI sareng dicincang dina mikroskop pikeun ngasingkeun kista.Beurit anu katépaan disimpen dina kaayaan bébas patogén (SPF) khusus di Seoul National University School of Medicine.
Total RNA diekstrak tina exosom turunan BV2, sél BV2 sareng jaringan nganggo miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jérman) numutkeun petunjuk produsén, kalebet waktos inkubasi pikeun léngkah élusi.Konsentrasi RNA ditangtukeun dina spéktrofotométer NanoDrop 2000.Kualitas microarrays RNA ditaksir nganggo bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Walanda).
DMEM kalawan 10% exosome-miskin FBS ieu disiapkeun ku ultracentrifugation dina 100,000g pikeun 16 jam dina 4 ° C sarta disaring ngaliwatan 0.22 μm filter (Nalgene, Rochester, NY, AS).Sél BV2, 5 × 105, dibudidaya dina DMEM ngandung 10% exosome-depleted FBS jeung 1% antibiotik dina 37 ° C jeung 5% CO2.Saatos 24 jam inkubasi, tachyzoites tina galur RH atanapi ME49 (MOI = 10) ditambahkeun kana sél jeung parasit non-invading dihapus dina sajam na refilled kalawan DMEM.Exosom tina sél BV2 diisolasi ku séntrifugasi diferensial anu dirobih, metode anu paling seueur dianggo.Resuspend pellet exosome dina 300 µl PBS pikeun RNA atawa analisis protéin.Konsentrasi exosom terasing ditangtukeun ngagunakeun kit assay protéin BCA (Pierce, Rockford, IL, AS) sareng spektrofotometer NanoDrop 2000.
Precipitates tina sél BV2 atanapi exosomes diturunkeun tina BV2 ieu lysed dina PRO-PREP ™ solusi ékstraksi protéin (iNtRon Biotéhnologi, Seongnam, Korea) jeung protéin dimuat kana Coomassie cemerlang biru patri 10% SDS polyacrylamide gél.Salaku tambahan, protéin ditransferkeun kana mémbran PVDF salami 2 jam.Western blots disahkeun nganggo antibodi Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) salaku spidol exosomal.HRP-conjugated embe anti mouse IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, AS) jeung LAS-1000 tambah luminescent analyzer gambar (Fuji Photographic Film, Tokyo, Jepang) dipaké salaku antibodi sekundér..Transmisi éléktron mikroskop dipigawé pikeun nalungtik ukuran jeung morfologi exosomes.Exosom anu diisolasi tina sél BV2 (6.40 µg / µl) disiapkeun dina bolong anu dilapis karbon sareng diwarnaan négatip ku 2% uranil asétat salami 1 mnt.Sampel anu disusun dititénan dina tegangan akselerasi 80 kV nganggo JEOL 1200-EX II (Tokyo, Jepang) dilengkepan kaméra CCD ES1000W Erlangshen (Gatan, Pleasanton, CA, AS).
exosomes BV2-turunan anu patri maké PKH26 Beureum Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, AS) pikeun 15 menit dina suhu kamar.Sél U87, 2 × 105, kalawan PKH26-dilabélan exosomes (beureum) atawa euweuh exosomes salaku kontrol négatip, ieu incubated dina 37 ° C pikeun 24 jam dina 5% CO2 incubator.Inti sél U87 diwarnaan ku DAPI (biru), sél U87 dibenerkeun dina 4% paraformaldehyde pikeun 15 mnt dina 4 ° C teras dianalisis dina sistem mikroskop confocal Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Jérman).bisa dititénan.
cDNA disintésis tina siRNA ngagunakeun sintesis untaian munggaran Mir-X siRNA sareng kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Jepang).PCR kuantitatif waktos nyata dilaksanakeun nganggo sistem deteksi PCR waktos nyata iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, AS) nganggo primer sareng témplat dicampur sareng SYBR Premix.DNA diamplifikasi pikeun 40 siklus denaturasi dina 95 ° C salila 15 detik sarta anil dina 60 ° C salila 60 detik.Data tina unggal réaksi PCR dianalisis ngagunakeun modul analisis data tina software sistem optik iQ™5 (Bio-Rad).Parobahan rélatif dina éksprési gén antara gén target nu dipilih jeung β-aktin/siRNA (jeung U6) diitung ngagunakeun métode kurva baku.Urutan primer anu digunakeun dipidangkeun dina Tabél 1.
Sél glioma 3 x 104 U87 diturunkeun dina piring 96-sumur sareng dicampur sareng exosom anu kainféksi Toxoplasma diturunkeun tina BV2 (50 μg / mL) atanapi exosom nonpulse diturunkeun tina BV2 (50 μg / mL) salaku kontrol dina jam 12, 18 sareng 36. .Laju proliferasi sél ditangtukeun ngagunakeun Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Jepang) (Tokoh Tambahan S1-S3) 46.
Beurit buligir awéwé 5-minggu BALB / c dibeuli ti Orient Bio (Seongnam-si, Koréa Kidul) jeung diteundeun individual dina kandang steril dina suhu kamar (22 ± 2 ° C) jeung kalembaban (45 ± 15 ° C).%) dina suhu kamar (22±2°C) jeung kalembaban (45±15%).Siklus cahaya 12 jam sareng siklus poék 12 jam dilaksanakeun dina SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Beurit sacara acak dibagi kana tilu kelompok 5 mencit masing-masing sareng sadaya kelompok disuntik sacara subkutan kalayan 400 ml PBS anu ngandung 1 x 107 U87 sél glioma sareng faktor pertumbuhan ngirangan BD Matrigel ™ (BD Science, Miami, FL, AS).Genep dinten saatos suntikan tumor, 200 mg exosom diturunkeun tina sél BV2 (kalayan / tanpa inféksi Toxoplasma) disuntikkeun kana situs tumor.Dua puluh dua poé sanggeus inféksi tumor, ukuran tumor mencit di unggal grup diukur ku caliper tilu kali saminggu, sarta volume tumor diitung ku rumus: 0,5 × (lebar) × 2 × panjang.
Analisis éksprési MicroRNA maké miRCURYTM LNA miRNA Asép Sunandar Sunarya, 7 generasi boga, mmu na rno arrays (EXIQON, Vedbaek, Denmark) ngawengku 1119 beurit well-dicirikeun diantara 3100 manusa, beurit jeung beurit miRNA newak panyilidikan.Salila prosedur ieu, 250 nepi ka 1000 ng tina total RNA dikaluarkeun tina 5′-fosfat ku perlakuan ku fosfatase alkali peujit sapi dituturkeun ku panyiri kalawan Hy3 ngalelep fluoresensi héjo.Sampel anu dilabélan teras dihibridisasi ku ngamuat slide microarray nganggo kit kamar hibridisasi (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) sareng kit slide hibridisasi (Agilent Technologies).Hibridisasi dilaksanakeun salami 16 jam dina 56 ° C, teras microarrays dikumbah saluyu sareng rekomendasi produsén.Slides microarray anu diolah teras diseken nganggo sistem scanner microarray Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Gambar anu diseken diimpor nganggo parangkat lunak Ekstraksi Fitur Agilent vérsi 10.7.3.1 (Agilent Technologies) sareng inténsitas fluoresensi unggal gambar diukur nganggo file GAL anu saluyu tina protokol Exiqon anu dirobih.Data microarray pikeun ulikan ayeuna disimpen dina database GEO handapeun nomer digentos GPL32397.
Profil éksprési miRNAs exosomal dewasa dina mikroglia RH atanapi ME49 galur anu kainfeksi Toxoplasma dianalisis nganggo sababaraha alat jaringan.miRNA anu aya hubunganana sareng kamekaran tumor diidentifikasi nganggo miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) sareng disaring kalayan inténsitas sinyal anu dinormalisasi (log2) langkung ageung tibatan 8.0.Diantara miRNAs, miRNAs dikedalkeun differentially kapanggih leuwih ti 1,5-melu dirobah ku analisis filter miRNAs dirobah ku RH atanapi ME49 galur kainfeksi T. gondii.
Sél diturunkeun dina piring genep sumur (3 x 105 sél / sumur) dina opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, AS) nganggo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, AS).Sél anu ditransféksi dibudidayakan salami 6 jam teras médium dirobih janten médium lengkep seger.Sél dipanén 24 jam saatos transfeksi.
Analisis statistik utamana dilakukeun ngagunakeun Student's t-test kalawan software Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Pikeun analisa sato ékspérimén, ANOVA dua arah dilakukeun nganggo parangkat lunak Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-nilai <0.05 dianggap signifikan sacara statistik. P-nilai <0.05 dianggap signifikan sacara statistik. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Nilai P <0.05 dianggap signifikan sacara statistik. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P <0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Nilai P <0.05 dianggap signifikan sacara statistik.
Sadaya protokol ékspérimén anu digunakeun dina ulikan ieu disatujuan ku Dewan Tinjauan Institusi di Seoul National University School of Medicine (IRB nomer SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Diperkirakeun incidence sareng mortalitas kanker global dina 2018: sumber sareng metode GLOBOCAN.Interprétasi.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Hiji wawasan kana faktor résiko tumor otak sarta interventions terapi maranéhanana. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Hiji wawasan kana faktor résiko tumor otak sarta interventions terapi maranéhanana.Rashid, S., Rehman, K. sarta Akash, MS A review faktor résiko pikeun tumor otak sarta interventions terapi utama. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Deep pamahaman faktor résiko tumor otak sarta interventions terapi.Rashid, S., Rehman, K. sarta Akash, MS A review faktor résiko pikeun tumor otak sarta interventions terapi utama.Élmu biomédis.Apoteker.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. interaksi baktéri-viral dina orodigestive manusa sarta kangker saluran séks bikang: A kasimpulan epidemiologic jeung bukti laboratorium. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. interaksi baktéri-viral dina orodigestive manusa sarta kangker saluran séks bikang: A kasimpulan epidemiologic jeung bukti laboratorium.Kato I., Zhang J. jeung Sun J. interaksi baktéri-viral dina kanker saluran cerna manusa jeung saluran séks bikang: kasimpulan data epidemiological jeung laboratorium. Kato, I, Zhang, J. & Sun, J. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. interaksi Baktério-viral dina nyerna rohangan lisan manusa jeung saluran réproduktif bikang: kasimpulan elmu kasakit populér sarta bukti laboratorium.Kato I., Zhang J. jeung Sun J. interaksi baktéri-viral dina kanker cerna manusa jeung kanker séks bikang: kasimpulan data epidemiological jeung laboratorium.Kanker 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Tina inféksi ka kanker: Kumaha virus tumor DNA ngarobih karbon sentral sél host sareng métabolisme lipid. Magon, KL & Parish, JL Tina inféksi ka kanker: Kumaha virus tumor DNA ngarobih karbon sentral sél host sareng métabolisme lipid.Mahon, KL sareng Parish, JL Inféksi Seuneu kana kanker: kumaha virus tumor dumasar DNA ngarobih karbon sentral sél host sareng métabolisme lipid. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢。 Magon, KL & Parish, JL Tina inféksi ka kanker: kumaha virus tumor DNA ngarobih karbon sentral sél host sareng métabolisme lipid.Mahon, KL jeung Parish, JL Seuneu inféksi ka kanker: kumaha virus tumor DNA ngarobah karbon sentral jeung métabolisme lipid dina sél host.Buka Biologi.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Éstrogén katékol tina schistosomes sareng flukes ati sareng kanker anu aya hubunganana helminth.hareup.panas jero.5, 444 (2014).